簡介
1974年Evans首次将染色體顯帶技術和染色體原位雜交聯合應用，提高了定位的準确性。20世紀70年代後期人們開始探讨熒光标記的原位雜交，即FISH技術。1981年Harper成功地将單拷貝的DNA序列定位到G顯帶标本上，标志着染色體定位技術取得了重要進展。20世紀90年代，随着人類基因組計劃的進行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，FISH技術得到了迅速的發展和廣泛應用。
原理
FISH(fluorescenceinsituhybridization)技術是一種重要的非放射性原位雜交技術。
它的基本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性-退火-複性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。将核酸探針的某一種核苷酸标記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素标記的特異親和素之間的化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。
實驗流程
FISH樣本的制備→探針的制備→探針标記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結果分析。
特點
原位雜交的探針按标記分子類型分為放射性标記和非放射性标記。用同位素标記的放射性探針優勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信号強度，故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。
采用熒光标記系統則可克服這些不足，這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系，有以下特點。
優點:
1、熒光試劑和探針經濟、安全；
2、探針穩定，一次标記後可在兩年内使用；
3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準确；
4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；
5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顔色可同時檢測多種序列；
6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。
缺點：不能達到100%雜交，特别是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。
應用
該技術不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳标記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。
FISH最初用于中期染色體。從正在分化的細胞核中制備的這種染色體是高度凝縮的，每條染色體都具有可識别的形态，它們染色後将顯現出特征性的着絲粒位置及染色帶型。在處理中期染色體時，通過測定FISH所獲得熒光信号相對于染色體短臂末端的位置（FLpter值）來進行作圖
使用中期染色體的不足之處在于，由于它的高度凝縮的性質，隻能進行低分辨率作圖，兩個标記至少分隔1Mb才能作為分開的雜交信号被分辨出來（Trasketal.，1991）。這種分辨率不足以構建有交往的染色體圖譜。
故此中期染色體FISH主要用于确定新标記在染色體上的大概位置，為其他更精細的作圖方法做準備。一直以來，這些“其他方法”并不包括任一種FISH，但1995年後，一系列高分辨率的FISH技術已發展起來。這些技術通過改變待研究的染色體制備的性質而達到較高的分辨率。中期染色體對于精細作圖來說凝縮度太高，因而我們需要選用較為伸展的染色體。
有兩種途徑可以滿足這一要求（Heiskanenetal，1996）：機械伸展的染色體（mechanicallystretchedchromosome）通過改變從中期細胞核中分享染色體的方法而獲得。離心産生剪切力可将染色體伸展到正常長度20倍。每條染色體仍可識别，而FISH信号作圖方法與通常處理的中期染色體相同，這樣，分辨率可明顯提高，能夠區分出相隔200~300kb的标記。
非中期染色體（non-metaphasechromosome）染色體僅在中期高度凝縮，而在細胞周期的其他階段保持天然未包裝狀态，有研究者曾利用前期細胞核，此時染色體凝縮程度足以區分出單個染色體。
實際應用中，這種方法并無優于機械伸展的染色體之處。相比之下分裂間期（interphase）的染色體更為有用，因為分裂間期（再次細胞核分裂之間）的染色體包裝程度最低。使用分裂間期的染色體，分辨率有可能達到25kb以下，但染色體形态特征消失，推動了定位探針位置所需的外部參照點。
因此，該技術可在已獲得染色體粗略圖譜後使用，通常作為确定染色體一段小區域内一系列标記物順序的方法。間期染色體含有去組裝的全部的細胞DNA分子。為了進一步提高FISH的分辨率到25kb以下，有必要放棄完整的染色體，而使用純化的DNA。這種方法叫做纖維-FISH（fiber-FISH），利用凝膠拉伸或分子梳理技術制備DNA，可以分辨間距小于10kb的标記。n
發展曆程
FISH技術檢測位點數目及檢測目标的發展
在FISH技術基本确立之後，FISH不僅用于單基因或核酸檢測，FISH技術的進一步發展擴展到多色FISH多基因位點同時檢測，從基因檢測發展到基因組、染色體、活細胞中轉錄産物mRNAs原位檢測以及組織水平的核酸檢測，并且在今後的研究中還有可能應用到整個生物體的檢測。
早期的探針較大，是通過載體的增殖、缺口平移法、體外轉錄法和随機引物DNA合成法來制備以獲得特異性雜交克隆。然而大片斷的探針通常帶有重複序列造成高熒光背景，采用未标記的核酸進行預處理使其與非特異性位點結合用于抑制非特異性雜交可以克服上述問題，同時也使得研究者擴大了檢測目标，實現了整條染色體染色。
在細胞遺傳學上FISH技術在染色體分析方面也因此得到了顯着的提高。如通過比較基因組雜交(Comparativegenomichybridization)用于檢測染色體區域的缺失和重複。大片段探針一旦和樣品非特異性結合就會形成一個信号，混淆染色體上基因的檢測，就需要剪切成小片段<200核苷酸。
現在檢測手段的提高以及檢測軟件的不斷發展使得FISH技術的檢測要求越來越低，靈敏度越來越高。精确的計算機圖片處理算法的不斷改進形成了亞顯微水平的探針高分辨技術。随着檢測目标越來越小，FISH技術已用于隐蔽的亞端粒核型基因重排和精确的染色體作圖及單拷貝mRNA的檢測。
FISH檢測範圍的擴大，使得FISH技術的應用在20世紀90年代急速增長。由FISH技術應用而形成的分支技術實現了越來越多的不同類型位點同時檢測。
首先是采用不同的熒光素來檢測多位點，如雙色熒光用于檢測特異的核酸序列，每一條染色體、基因或者轉錄産物分别由一種可以分辨的熒光信号來表示。之後是采用兩種色彩譯碼方案進一步擴大了FISH應用範圍。
譯碼方案主要是針對色彩比例，即每一種顔色在總顔色中所占的比例來描繪多位點。前述的每一種方法，或是兩種方法的結合都已經将可檢測位點多達12個。
采用計算機翻譯的五色方案可同時檢測出人類所有染色體代表着FISH技術多位點檢測的裡程碑。盡管可以采用多種方法觀測到mRNAs，但是FISH對整個轉錄産物的原位分析似乎更有應用前景。色彩譯碼技術已經實現了對整個組織的檢測。n
FISH技術的定量分析階段
Pinkel等(1986)首次将熒光圖像定量分析用于基本細胞遺傳檢測，采用雙色激發塊裝置照相機檢測熒光信号，而且定量分析技術很快用于了mRNA檢測。熒光檢測的關鍵是信号的重現性、無規律性及背景的自發熒光。
不僅不同的樣品之間熒光不同，而且同一載玻片上的材料或者同樣的細胞都有可能顯示出不均衡的熒光。目前已有多種方法用于消除一些組織中的自發熒光:如樣品制備過程中，采用的消除自發熒光試劑包括硼氫化鈉或者采用光照輻射進行預處理以消除非特異性背景信号。這些消除自發熒光的方法并不完全有效，通常在進行圖像分析時通過計算機算術除去自發熒光信号。
熒光圖像的光譜數據包括真正的信号和許多雜噪，分别進行分析并且通過單獨的光譜組分分析除掉雜噪數據。多色FISH有自身的限制，包括不同的熒光強度和顔色重疊。但是通過計算機算法分析平衡了多色圖像，包括強度變化和自動糾正信号重疊。
FISH圖像自身的限制并沒有影響到自動破譯算法的發展。采用序列較大探針進行DNA位點檢測和多色熒光計數算法輔助病理學家實現了自動化分析。此外，檢測探針試劑盒和點計數方法的應用為便捷的檢測結果提供了一個平台。盡管多種方法已經用于分析或優化自動細胞檢測系統，人工的細胞病理檢測仍是可信度高的組織分析方法。
然而，細胞制備、鑒别、固定介質上細胞樣品計算機化檢測在未來的醫學診斷中的高效益性不容忽視，快速檢測細胞内的分子信号隻有通過計算機輔助方法進行檢測。現在，自動化檢測程序已經擴展到采用多基因轉錄模型檢測特異的DNA簇和轉錄位點以确定功能細胞的狀态。n
FISH技術檢測領域的發展
鑒于FISH起始階段的發展主要是探針類型和檢測位點的擴展，熒光檢測技術将來的發展可能包括檢測領域的擴展。熒光圖像臨床診斷應用需要在檢測體系上進一步提高，如探針的結合，照相和分析的自動化，因此避免了不同操作間的誤差。樣品厚度是熒光顯微鏡檢測樣品類型的一個限制因素。
近來的激光共聚焦顯微鏡和光學X射線斷層攝影技術要求樣品厚度達到1~2mm。一種改進的光學投射X顯微斷層攝影技術可以獲取到15mm厚樣品的圖像擴大了生物學和診斷樣品的檢測範圍。活細胞的RNAsFISH技術檢測也有報道。既可以采用體内釋放的熒光集團也可以采用雜交後探針的熒光素進行檢測。
這兩種新方法都可以降低非特異性标記探針存在時的高背景(如活細胞)，可以用于追蹤mRNA的合成和轉移途徑。這些方法較綠色熒光蛋白(Greenfluorescenceprotein,GFP)更易于檢測不同靶分子。相對于GFP活細胞原位雜交檢測，FISH易受到細胞内合成探針的影響。
FISH需要進一步的改進以降低活體基因表達檢測時的幹擾背景，避免細胞内自身雜交物的幹擾。其實完全可以不必考慮FISH檢測和熒光檢測蛋白技術的差異，将FISH技術和熒光蛋白技術結合起來可以同時檢測目的核酸和蛋白。
多光子顯微技術的應用進一步擴大了熒光圖像的應用範圍。采用多光子顯微鏡，激光塊可以發射光子聚焦于顯微鏡兩到三次激發目的熒光素。采用近紅外激發光可以更深層次穿透生物樣品，比可見光對活體樣品造成的毒性低。這種新方法的應用已将熒光圖像用于活體系統的檢測，甚至整個動物體。
由于還不能合成生物體标記探針，因此目前生物體内熒光圖像的應用隻限于檢測熒光分子或生物體自發熒光。生物組織在正常的生理或者病理生理過程中産生的自發熒光信号可以作為一種重要的診斷信号。一旦生物體探針成為可能，将會成為鑒别特異核酸序列，進行非入侵診斷，獲取診斷圖像的一種有力輔助手段。n
