纖維素酶

纖維素酶

降解纖維素生成葡萄糖的一組酶
纖維素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱,它不是單體酶,而是起協同作用的多組分酶系,是一種複合酶,主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成,還有很高活力的木聚糖酶。作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的産物。微生物纖維素酶在轉化不溶性纖維素成葡萄糖以及在果蔬汁中破壞細胞壁從而提高果汁得率等方面具有非常重要的意義。[1]
    中文名:纖維素酶 外文名:cellulase 别名: 性質:複合酶 應用領域:飼料、酒精、紡織和食品等

基本資料

纖維素酶(英文:cellulase)是酶的一種,在分解纖維素時起生物催化作用。

是可以将纖維素分解成寡糖或單糖的蛋白質。

纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細菌、真菌、動物體内等都能産生纖維素酶。一般用于生産的纖維素酶來自于真菌,比較典型的有木黴屬(Trichoderma)、曲黴屬(Aspergillus)和青黴屬(Penicillium)。

産生纖維素酶的菌種容易退化,導緻産酶能力降低。

細菌産纖維素酶的産量較少,主要是葡聚糖内切酶,大多數對結晶纖維素無降解活性,且所産生的酶多是胞内酶或吸附在細胞壁上,不分泌到培養液中,增加了提取純化的難度,因此對細菌的研究較少。但由細菌所産生的纖維素酶一般最适pH為中性至偏堿性。近20年來,随着中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業中的成功應用,細菌纖維素酶制劑已顯示出良好的應用前景。

纖維素酶在食品行業和環境行業均有廣泛應用。在進行酒精發酵時,纖維素酶的添加可以增加原料的利用率,并對酒質有所提升。

由于纖維素酶難以提純,實際應用時一般還含有半纖維素酶和其他相關的酶,如澱粉酶(amylase)、蛋白酶(Protease)等。

纖維素酶種類繁多,來源很廣。不同來源的纖維素酶其結構和功能相差很大。由于真菌纖維素酶産量高、活性大,故在畜牧業和飼料工業中應用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。

種類

1.纖維素酶的組成與功能

纖維素酶根據其催化反應功能的不同可分為内切葡聚糖酶,來自真菌的簡稱EG,來自細菌的簡稱Cen,外切葡聚糖酶,來自真菌的簡稱CBH,來自細菌的簡稱Cex)和β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase,EC.3.2.1.21)簡稱BG。内切葡聚糖酶随機切割纖維素多糖鍊内部的無定型區,産生不同長度的寡糖和新鍊的末端。

外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鍊的末端,釋放葡萄糖或纖維二糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖産生兩分子的葡萄糖。真菌纖維素酶産量高、活性大,在畜牧業和飼料工作中主要應用真菌來源的纖維素酶。

2.纖維素酶降解纖維素的機理研究

纖維素酶反應和一般酶反應不一樣,其最主要的區别在于纖維素酶是多組分酶系,且底物結構極其複雜。由于底物的水不溶性,纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES複合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上,然後在幾種組分的協同作用下将纖維素分解成葡萄糖。

1950年,Reese等提出了C1-Cx假說,該假說認為必須以不同的酶協同作用,才能将纖維素徹底的水解為葡萄糖。協同作用一般認為是内切葡聚糖酶(C1酶)首先進攻纖維素的非結晶區,形成Cx所需的新的遊離末端,然後由CX酶從多糖鍊的還原端或非還原端切下纖維二糖單位,最後由β-葡聚糖苷酶将纖維二糖水解成二個葡萄糖。

不過,纖維素酶的協同作用順序不是絕對的,随後的研究中發現,C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必須同時存在才能水解天然纖維素。若先用C1酶作用結晶纖維素,然後除掉C1酶,再加入Cx酶,如此順序作用卻不能将結晶纖維素水解。

影響纖維素酶作用的因素

纖維素酶的最适pH一般在4.5~6.5。葡萄糖酸内酯能有效的抑制纖維素酶,重金屬離子如銅和汞離子,也能抑制纖維素酶,但是半胱氨酸能消除它們的抑制作用,甚至進一步激活纖維素酶。植物組織中含有天然的纖維素酶抑制劑;它能保護植物免遭黴菌的腐爛作用,這些抑制劑是酚類化合物。如果植物組織中存在着高的氧化酶活力,那麼它能将酚類化合物氧化成醌類化合物,後者能抑制纖維素酶。

菌種選育

菌種選育是纖維素酶生産的基礎性工作,國内外許多專家進行了大量研究,為了生産高質量的纖維素酶産品,王家林等(1996)在吸收國内外經驗的基礎上,先後引進了綠色木黴木10、綠色木黴Sn-91014、康氏木黴NT-15、黑曲黴XX-15A,在此基礎上,采用了紫外線、特定電磁波輻射、線性加速器,亞硝基胍等物理、化學的誘變方法,獲得了高産菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。

其中木黴NT-15H固體培養活力經輕工部食品質量監督檢測中心南京站檢測表明,濾紙活力為3670u/g,C1-酶活力24460u/g,Cx-酶活力1800u/g,已達到國際先進水平。此菌種在工廠化生産中性能穩定。張苓花等(1998)采用康氏木黴W-925,J-931,經過濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線(15W、30cm、2min)複合誘變後,得到了産酶活性高的Wu-932菌種,該菌種CMC糖化力達到2975,濾紙糖酶活性為531,比出發菌W-925分别提高了100%和81%。

化工部飼料添加劑技術服務中心王成書等(1997)采用該中心的裡氏木黴A3先進行紫外線和亞硝基胍複合誘變後,将處理過的孢子接種于纖維雙層平闆上,30℃培養5-8天,15℃放置7-10天,挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固态發酵再篩選,得到了産纖維素酶活力很高的裡氏木黴91-3菌株。

纖維素酶菌種易退化,退化後其産酶力明顯降低,其原因可能有三個方面:

①經誘變篩選的菌種發生回複突變。

②自然負突變。

③菌種長時間低溫斜面保藏,會在分生孢子上長出次生菌絲,而次生菌絲所形成的分生孢子生命力弱,這可能是菌種退化的主要原因。為了避免纖維素酶菌種退化,張苓花等(1998)報道,采用砂土管保藏菌種。即将過篩洗淨的砂子與土以3:2比例混合分裝在試管内,用1kg/cm2壓力滅菌30分鐘共三次,将欲保存的斜面菌種制備成1000ml孢子懸浮液,每個砂土管注入0.5ml,搖勻,放入盛有無水CaCl2真空幹燥器内保存。

經測定,在所測的121天内,酶的活性基本不變;酶活性下降50%的時間,由常規方法的60天延長至160天,明顯地減緩了菌種退化速度。

發酵工藝

纖維素酶的生産工藝主要有兩種,即固體發酵和液體發酵,其工藝如下(見下頁):

1、影響産酶量和活力的因素:影響纖維素酶産量和活力的因素很多,除菌種外,還有培養溫度、pH、水分、基質、培養時間等。這些因素不是孤立的,而是相互聯系的。張中良等(1997)采用均勻設計Cl12(1210),以綠色木黴(T.ViriclePers.expr)為菌種,研究了影響産纖維素酶的五大因素對産酶量和活力的作用,認為基質粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃條件下培養45h可獲得最大産酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g·h。

王成華等(1997)也研究了其誘變篩選的裡氏木黴91-3的産酶條件,結果表明該菌種以7:3的稭稈粉和麥麸,另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養基,28-32℃為适宜培養溫度,30℃為最佳溫度,4%為最佳接種量,96h到達發酵高峰。

張苓花等(1998)研究了以康氏木黴W-925為出發菌,經誘變後得到的Wu-932纖維素酶高産菌的最佳發酵條件。結果表明,以1:2的麥麸和稻草粉為培養基,5%的接種量,稻草粉碎平均長度3-5mm,初始pH4-5,溫度在28-35℃,發酵時間72h為最佳發酵條件。

2、污染菌的控制:目前,在用康氏木黴發酵生産飼用纖維素酶中,普遍存在一種俗稱的“白毛菌”污染。污染後輕者酶活性下降,重者發酵失敗。為此,研究控制發酵污染意義很大。張苓花等(1998)研究“白毛菌”的菌落特征、來源、生長和生理特征及控制方法,找到了一種與康氏木黴Wu-932呈共生關系,而與“白毛菌”呈競争性抑制關系的熱帶假絲酵母菌J-931。利用此菌進行混合發酵,可有效地控制“白毛菌”的污染。其微生态關系如下:

應用

畜禽飼料

常見的畜禽飼料如谷物、豆類、麥類及加工副産品等都含有大量的纖維素。除了反刍動物借助瘤胃微生物可以利用一部分外,其它動物如豬、雞等單胃動物則不能利用纖維素。近年來,國内外利用真菌纖維素酶成為提高畜禽生産性能和飼料利用率的重要措施之一。

1、在牛日糧中的應用

焦平林等(1996)用閹牛試驗,在日糧中按每頭每日添加纖維素酶40g,飼喂60天,結果表明加酶組日增重892.78g,對照組日增重746.8g,差異極顯着(P<0.01)。焦平林又用30頭荷斯坦奶牛進行試驗,試驗組按每頭每日添加50g纖維素酶,結果表明,試驗組15頭奶牛在68天總産奶量為2916kg,而對照組15頭奶牛在68天的總産奶量為2689kg,差異顯着(P<0.05)。

付連勝等(1998)報道,在瘤胃功能正常狀态下,成年奶牛及育成牛飼喂纖維素酶5天後,其糞便幹物質和飼喂前相比,減少30%,一周後,封閉式牛舍氨含量下降70%左右,粗飼料采食量提高8-10%,尿中尿素下降58.9%,懷孕奶牛在産前30天始飼喂纖維素酶,分娩後,不産生生理性消化不良症狀,胎兒體重可增加1.5-3kg,并無畸形和弱胎。産牛體質恢複快,産奶高峰維持時間長(一直至第四個泌乳月)。趙長友等(1998)綜述了纖維素酶在草食動物日糧中的應用,均取得了顯着效果。

2、在雞日糧中的應用

肉雞日糧一般以高魚粉、高玉米、高豆粕為主。為減少這些常規原料的使用量,廣泛采用廉價的飼料原料,秦江帆等(1996)在肉雞日糧中提高富含纖維的麥麸比例,添加0、0.05%、0.1%纖維素酶制劑進行試驗,結果表明,添加0.1%纖維素酶組比對照組在1-2、3-6、7-8周三個生長階段日增重分别提高4.31%、4.54%、4.13%,耗料比分别下降1.56%、4.50%、4.3%。徐奇友(1998)在蛋雞日糧中添加0.1%、0.15%、0.5%纖維素酶。

結果表明,在1-10月的産蛋期間,産蛋率分别提高0.53%、1.25%、2.88%,酶水平0.15%和0.5%組的破蛋率降低34.49%、16.19%,蛋殼強度分别提高14.71%和8.41%。

3、在豬日糧中的應用

據尹清強等(1992)報道,在基礎日糧中添加0.6%和1.2%纖維素複合酶,結果生長育肥豬增重比對照組分别提高16.84%和21.86%。Wank等(1993)報道,添加纖維素酶,使中性洗滌纖維消化率由30.3%提高到34.1%,酸性洗滌纖維消化率從68.8%提高到73.9%,能量消化率由69.3%提高到71.8%。

2.在酒精發酵中的應用

纖維素是一種資源十分豐富的可再生能源。纖維素是一種資源十分豐富的可再生能源。二次大戰後,石油開發和石油加工工業飛速發展,以石油加工工業為基礎的合成酒精大生産,其價格低于發酵法酒精,因此大部分發酵酒精廠都倒閉了,特别是纖維酒精廠,隻有在前蘇聯還繼續在開工生産。20世紀50年代,木材稀酸水解酒精發酵在前蘇聯還得到了一定的發展。近20年,由于科學技術的進展,纖維素酶活力的提高;連續制備纖維素酶新工藝的研究取得成功;纖維素預處理技術得到發展。

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