牛血清白蛋白

牛血清白蛋白

牛血清球中的蛋白類型
牛血清白蛋白[1],稱牛血清蛋白,又稱第五組分,英文名稱為Bovine Serum Albumin,也稱Bovine albumin,或Cohn FractionV,簡稱BSA。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用,例如在western blot中作為Blocking agent;在酶切反應緩沖液中加入BSA,通過提高溶液中蛋白質的濃度,對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附,能減輕有些酶的變性,能減輕有些不利環境因素如加熱,表面張力及化學因素引起的變性。
    中文名:牛血清白蛋白 外文名:Bovine albumin 别名: 分子式:N/A 分子量:66.446KDa 類 别:球蛋白 來 源:牛血清 CBNumber:CB5107573 CAS号:9048-46-8 中文同義詞:蛋白粉;牛白蛋白;卵蛋白粉;血清蛋白;血清白蛋白;牛血蛋白質;複合氨基酸;牛血清蛋白;牛血清白蛋白;血清白蛋白(牛)

主要成份

蛋白質

是牛血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類蛋白外主要還有白蛋白,球蛋白。纖維粘連素細胞促進細胞附着;α2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含胎球蛋白促細胞附着;轉鐵蛋白能結合鐵離子,減少其毒性和被細胞利用。

多肽

血小闆促生長因子能促細胞分裂,是多肽家庭的主要成員之一,是主要的促細胞增殖因子;成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經細胞生長因子等,血清中含量雖很少,但對細胞生長也有一定作用。

激素

激素對細胞的作用是多方面的。

胰島素:促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸,與促細胞分裂有關。

類胰島素生長因子:能與細胞表達的胰島素受體結合,從而有胰島素同樣的作用。

促生長激素:促細胞增殖效應。

其他成份

氨基酸、葡萄糖、酮酸等對多種營養成分的合成培養基意義不大。與蛋白相結合狀态的微量元素對細胞培養有意義。

結構與作用

成分結構

牛血清中的簡單蛋白,是血液的主要成分(38g/1000ml),分子量68kD。等電點4.8。含氮量16%,含糖量0.08%。僅含己糖和己糖胺,含脂量隻有0.2%。白蛋白由581個氨基酸殘基組成,其中35個半胱氨酸組成17個二硫鍵,在肽鍊的第34位有一自由巯基。白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質結合。血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養作用。在動物細胞無血清培養中,添加白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用。牛血清白蛋白(BSA),又稱第五組分,是牛血清中的一種球蛋白,包含583個氨基酸殘基,分子量為66.430Da,等電點為4.7。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用,例如在western blot中作為Blocking agent。

作用

BSA一般做為穩定劑被用于限制酶或者修飾酶的保存溶液和反應液中,因為有些酶在低濃度下不穩定或活性低。加入BSA後,它可能起到“保護”或“載體”作用,不少酶類添加BSA後能使其活性大幅度提高。不需要加BSA的酶加入BSA一般不會受到什麼影響。對多數底物DNA而言,BSA可以使酶切更完全,并可實現重複切割。在37℃,酶切反應超過1h時,BSA可以使酶更加穩定,因為在不含BSA的反應緩沖液中,許多限制性内切酶在37℃下隻能存活10"20min甚至更短的時間。而BSA可以結合緩沖液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金屬離子和其它化學物質。

緩沖液

1.BSA是酶的穩定劑,防止酶的分解和非特異性吸附;

2.BSA能減輕有些酶的變性,能減輕有些不利環境因素如加熱,表面張力及化學因素引起的變性的,可能是因為它結構中有17個二硫鍵,和一個巯基,巯基的化學反應很活潑,二硫鍵有抗氧化還原的作用,因此可與多種陽離子,陰離子和小分子結合;

3.BSA能防止酶吸附到管壁而損失。

用途

1、用于生化研究、遺傳工程和醫藥研究

2、用作醫藥保健食品、調味品

3、維持滲透壓、pH緩沖、載體作用

4、在PCR體系中有助于Taq酶的穩定性及活性,可以提高PCR的效率

生産方法

以牛血為原料分離出血清,用硫酸铵分級沉澱後,經辛酸處理精制而得。

貯存方法

每10克加100毫升水進行溶解,或用PBS溶解也可,視用途而決定。然後分裝成小支。若不使用防腐劑可貯存在零下20或30攝氏度的恒溫櫃中,若使用防腐劑(如0.1%疊氮化鈉)則可貯存在零上4攝氏度的環境下。一般可存放數月不變質。防腐劑可能對牛血清白蛋白的效果造成影響,應慎用。

應用

牛血清白蛋白(BSA)在生化實驗中有廣泛的應用,例如在WB實驗中加入BSA,通過提高溶液中蛋白質的濃度,對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附,能減輕有些酶的變性,減輕不利環境因素如加熱,表面張力及化學因素引起的變性的。

測定蛋白濃度

按50:1配置BCA工作液。10ulC液(蛋白标準)+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白标準液。再分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标準液加入96孔闆的第1~8标準孔中,在其他樣品孔中加入10ul待測樣品。分别加PBS定容至20ul。各孔中加入200ulBCA工作液,室溫放置2小時。用酶标儀測定蛋白濃度:測定A562,依标準曲線算出蛋白濃度。

SDS-PAGE電泳

1、制膠:按比例配制分離膠,緩緩地搖動溶液,使激活劑混合均勻,将凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,再在液面上小心注入一層水,以阻止氧氣進入凝膠溶液中,靜置40min。同前按比例配制濃縮膠,但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續系統中下層分離膠上的水分,連續平穩的注入凝膠溶液,然後小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡,靜制60min以上以保證完全聚合。

2、預電泳:将聚合好的凝膠安置于電泳槽中,小心拔去梳子,加入電泳緩沖液後低電壓10-20V的預電泳20-30min。(目的是清除凝膠内的雜質,疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通)。

3、樣品準備:首先計算上樣體積,然後按樣品:上樣buffer=4:1的比例加入上樣bufer混勻,沸水10分鐘,冰上5分鐘。

4、加樣:預電泳後依次加入标準品(Marker)和待分析樣品。(加樣時間要盡量短,以免樣品擴散,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。每個泳道加5ul。

5、電泳:加樣完畢,選擇80V恒壓進行電泳,電泳直至溴酚藍染料前沿到達兩膠交界處(一般約20分鐘),更換至100V恒壓電泳,電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處,即停止電泳(一般約為1小時20分鐘)。

研究與優化

建立冬淩草乙素藥物濃度的液相色譜-串聯質譜分析方法,研究其與牛血清白蛋白(BSA)的結合情況以分析冬淩草乙素的血清蛋白結合機制。采用超濾法結合LC-MS/MS測定冬淩草乙素與牛血清白蛋白的蛋白結合率及相關結合常數,以Scatchard方程計算冬淩草乙素與BSA的結合常數(Ka)和結合位點數(n),并對冬淩草乙素與BSA的結合機制進行分析探究。結果顯示冬淩草乙素與牛血清白蛋白的平均結合率為57.2%,且結合類型主要為一類強結合,相關參數為結合常數,結合位點的數目為n=0.75。冬淩草乙素與牛血清白蛋白的結合在考察濃度範圍内無濃度依賴。該研究建立的方法靈敏度高、專屬性強、操作簡單,能夠滿足分析要求,結合常數的求算為臨床藥物相互作用以及藥動學研究奠定了基礎

目的優化《中國藥典》三部(2015版)通則50中Lowry法2試驗條件,進一步提高檢測結果的準确性,并進行方法學驗證,為柱純化組分百日咳疫苗中間品蛋白準确定量提供參考。方法用Lowry法2測定經脫氧膽酸鈉-三氯乙酸預處理的不同濃度且含50%甘油的牛血清白蛋白,使福林酚反應在20℃水浴條件下分别靜置30、40和50min,篩選出蛋白含量測定值相對誤差最小的反應時間;再在10、20和30℃條件下,篩選出相對誤差最小的反應溫度。對該方法進行精密度、準确度、專屬性驗證,并确定線性範圍。結果福林酚反應溫度為30℃、反應時間為30min時,測定值的平均相對誤差最低,與其他試驗條件的差異有統計學意義(P0.05)。在該試驗條件下,同一工作日不同試驗人員間及同一試驗人員不同工作日檢測結果的RSD均小于2.00%,重複性檢測結果RSD為0.50%,精密度良好;30、50和70μg/mL蛋白溶液測定值的RSD均小于2.00%,回收率在99%~102%之間,可對蛋白準确定量;含甘油50μg/mL蛋白溶液的回收率及其RSD分别為102%和0.50%;不含甘油對照組回收率和RSD分别為100%和0.82%,專屬性良好;在0~140μg/mL标準範圍内,檢測含甘油樣品的測定範圍在15~140μg。結論采用Lowry法2測定含高濃度甘油的蛋白樣品時,福林酚反應溫度、反應時間是影響試驗結果的重要因素。30℃條件下反應30min,可提高測定結果的準确性,符合且更有利于柱純化組分百日咳疫苗中間品的蛋白定量的要求

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