木瓜蛋白酶:番木瓜中含有的特異性蛋白水解酶-中文百科頻道

簡介

組成結構

番木瓜未成熟果實中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(ChymopapainA)、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapainB)、木瓜肽酶B(PapayaPeptidaseB)等多種蛋白水解酶。且已知四種半胱氨酸蛋白酶的一級結構具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶屬巯基蛋白酶，可水解蛋白質和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端，并能優先水解那些在肽鍵的N-端具有二個羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵。

木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，分子量為23406，由一種單肽鍊組成，含有212個氨基酸殘基。至少有三個氨基酸殘基存在于酶的活性中心部位，他們分别是Cys25、His159和Asp158，當Cys25被氧化劑氧化或與金屬離子結合時，酶的活力被抑制，而還原劑半胱氨酸（或亞硫酸鹽）或EDTA能恢複酶的活力。另外六個半胱氨酸殘基形成了三對二硫鍵,且都不在活性部位。純木瓜蛋白酶制品可含有：

（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，約占可溶性蛋白質的10%；

（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，約占可溶性蛋白質的45%；

（3）溶菌酶，分子量25000，約占可溶性蛋白質的20%；及纖維素酶等不同的酶。

化學性質

木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、堿性環境下均能分解蛋白質的蛋白酶。它的外觀為白色至淺黃色的粉末，微有吸濕性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液為無色或淡黃色，有時呈乳白色；幾乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有機溶劑。木瓜蛋白酶是一種含巯基(-SH)肽鍊内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力，但幾乎不能分解蛋白胨。

木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性時亦有作用，等電點（pI）為8.75；木瓜蛋白酶的最适合溫度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐熱性強，在90℃時也不會完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質激活。

催化機制

木瓜蛋白酶的剪切肽鍵的機制包括：在His-159作用下Cys-25去質子化，而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環的擺放，使得去質子化可以發生；然後Cys-25親核攻擊肽主鍊上的羰基碳，并與之共價連接形成酰基－酶中間體；接着酶與一個水分子作用，發生去酰基化，并釋放肽鍊的羰基末端。

功能特性

《GB 2760-2011食品安全國家标準食品添加劑使用标準》規定，木瓜蛋白酶可用作食品工業在的加工助劑（酶制劑）。一般應在制成最後成品之前除去（規定有殘留量者除外）。

木瓜蛋白酶主要用于啤酒抗寒（水解啤酒中的蛋白質，避免冷藏後引起的渾濁）、肉類軟化（水解肌肉蛋白和膠原蛋白，使肉類軟化）、谷類預煮的準備、水解蛋白質和肉類香料的生産。在啤酒抗寒和肉類軟化方面的應用遠比其他蛋白酶類廣泛。用量一般為1～4mg/kg促使餅幹中面筋的分解，以使成品松軟。肉類軟化有多種蛋白酶可用，比較如下表所列。

通過測定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力大小，可判斷嫩肉粉質量優劣的參考依據：把嫩肉粉溶于鹽酸半胱氨酸溶液，取該混合液與酪蛋白溶液反應10min，用紫外分光光度法測得反應所生成酪氨酸的含量。該方法具有較好的準确性和重現性。以每分鐘水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需樣品的量為1個酶活力單位。

國内産地

在中國，木瓜種植主要分布在廣西的橫縣和邕甯縣等地，屬于廣西特産水果，因此，木瓜蛋白酶生産廠家主要集中在廣西南甯市，木瓜蛋白酶的生産和研究有将近20年的時間。

生産方法

由木瓜的未成熟果實，經提取乳液、凝固、沉降、幹燥而成粗制品。一般工業上以粗制品的應用為主。木瓜蛋白酶韻生産方法有三種，分别是直接熱風烘幹法、噴霧幹燥法及膜分離凍幹法。

直接烘幹

生産方法較簡單、快速，但生産出來的成品隻是粗酶，雜質多、色澤差且微生物超标，酶活力也較低，隻有60萬～80萬單位/g。多為個體工廠采用，已不能滿足國内食品質量衛生安全等。

噴霧幹燥

此法是先通過離心去除部分雜質後再進行噴霧幹燥，所生産出的成品酶活力相對高，達到100萬單位/g左右，雜質相對也較少，色澤相對也較白。但産品噴霧時容易粘壁，酶活損失較大，水溶性相對也較差，而且酶活穩定性也較差。

膜分離法

該生産方法不但避免了以上兩種方法的缺點，且生産過程衛生安全，收率也高，所生産的成品酶活損失小，酶活力一般可達到280萬～350萬單位/g，最高可達400萬單位/g，且酶活穩定性好，純度高，色澤潔白，細菌數低，嚴格操作可達到醫藥級别。

其提取工藝條件為超聲波功率300W，超聲處理時間200s，果漿質量分數30%；經超聲波強化提取，酶活力提高到原先的1.71倍；該酶在40℃以下，pH為5.4～6.0時酶活力相對穩定；EDTA、Cys和維生素C對酶活力具有激活作用，CuS04和ZnCl2具有抑制作用，而KCl、NaCI、CaCl2、MgS04對酶活力的影響不大。

木瓜蛋白酶的分離純化工藝：采用初步采集處理，20%、40%硫酸铵分級沉澱、SP-sephadexC50柱色譜、羟基磷灰石柱色譜，從番木瓜乳汁中分離純化木瓜蛋白酶。可獲得比活為1184U/mg的純酶，活力回收率為55.79%，純度達到99.31%，為高純度的木瓜蛋白酶。

酶活測定

本方法僅适用于木瓜蛋白酶。

基本原理

木瓜蛋白酶能使N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（底物）水解而釋出N-苯甲酰-L-精氨酸，其釋出量可用氫氧化鈉液滴定，以此确定酶活力。

酶活單位

在25℃下，每分鐘内能催化分解1umol底物的酶量，稱為1單位。

試液制備

1、底物溶液：準确稱取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽1.42g，加10mmol/LEDTA、50mmol/L半胱氨酸液2.6mL，加适量水，用0.1mol/L氫氧化鈉液調節pH至6.2，最後定容至50.0mL。

2、待測酶液：取試樣用水稀釋至适當濃度，并調節至pH6.2。

測定方法

25℃恒溫條件下，取25mL燒杯裝在pH自動滴定儀上，加底物溶液3.75mL、3mol/L氯化鈉溶液2.50mL、重蒸餾水1.25mL，混合後加入待測酶液後立即計時，用0.1mol/L氫氧化鈉在電磁攪拌下連續滴定以保持pH6.2，記下每分鐘所耗0.01mol/L氫氧化鈉毫升數。同時進行空白校正。按下式計算木瓜蛋白酶的活力P（單位/mg）：

P=C·ΔV·1000/W

式中：c：氫氧化鈉液的濃度，mol/L；ΔV：每分鐘消耗氫氧化鈉液的體積減去空白值；W：反應液中木瓜蛋白酶的質量，mg。

應用範圍

木瓜蛋白酶在醫藥、食品、飲料、化學試劑、飼料、紡織化妝品等方面都有廣泛的應用，開發前景廣闊。

食品工業

在食品行業中，木瓜蛋白酶可用于肉類嫩化、啤酒澄清、餅幹松化等用途。

啤酒澄清劑

引起啤酒冷藏混濁時主要原因是啤酒中的蛋白質極易與多元酚結合成大分子的複合物。利用啤酒澄清劑中的木瓜蛋白酶對形成混濁的蛋白質有廣泛的特異性，能把大分子的蛋白質降解成小分子的物質，提高了蛋白質與多元酚複合物的溶解度；另一方面，木瓜蛋白酶是一種具有生物活性的蛋白質，該蛋白質可與引起啤酒冷藏混濁的多元酚形成穩定狀态平衡，防止了啤酒的冷藏混濁。

肉類嫩化劑

利用木瓜蛋白酶能裂解肉類中的膠原蛋白和肌肉纖維，而使肉的結構松散。由于木瓜蛋白酶是半胱氨酰基蛋白酶，能降解膠原纖維和結締組織蛋白質，它将肌動球蛋白和膠原蛋白降解成為小分子的多肽甚至氨基酸,令肌肉肌絲和筋腰絲斷裂,使肉類變得嫩滑，并簡化蛋白質結構使人體食用後易于消化吸收。

餅幹松化劑

利用木瓜蛋白酶的酶促反應,将面團的蛋白質降解為小分子的膚或氨基酶,降低了面團的拉伸阻力,使面團變得柔軟、更有可塑性,減少彈性,易于成型。用量視餅幹廠的加工方法和面團中蛋白質的含量不同而不同，研究表明每公斤面添加0.6-1.0萬單位/克為佳。