RNA病毒:病毒的一種-中文百科頻道

類型

病毒的核酸包括雙鍊DNA（dsDNA）、單鍊DNA（ssDNA）、雙鍊RNA（dsRNA）、單鍊RNA（ssRNA）等不同類型；病毒顆粒中的組成成分有簡有繁，有的用顆粒自帶專門于病毒複制的核酸酶，有的則無。有的病毒核酸并不僅有一個分子，如流感病毒有8條RNA，呼腸孤病毒有11-12條dsRNA。由于病毒種類繁多，核酸類别不同，因而病毒的複制機制不盡相同。

ssRNA病毒的複制

有些ssRNA病毒，一旦病毒顆粒中的RNA進入寄主細胞，就直接作為mRNA，翻譯出所編碼的蛋白質，其中包括衣殼蛋白和病毒的RNA聚合酶。然後在病毒RNA聚合酶的作用下複制病毒RNA，最後病毒RNA和衣殼蛋白自我裝配成成熟的病毒顆粒。這類病毒很多，如ssRNA噬菌體、脊髓灰質炎病毒、鼻病毒、TMV等。

還有另一類ssRNA病毒，它們的複制特點是病毒顆粒中的ssRNA病毒為負鍊，進入寄主後不能直接作為mRNA，而是先以負鍊RNA為模闆由轉錄酶轉錄出與負鍊RNA互補的RNA，再以這個互補RNA作為mRNA翻譯出遺傳密碼所決定的蛋白質。這類病毒稱之為負鍊非侵染型病毒，如濾泡性口腔炎病毒、流感病毒、副流感病毒、莴苣壞死黃化病毒等。

此外，還有一類特殊的ssRNA病毒即反轉錄病毒。該類病毒通常引起人和動物的腫瘤，其中包括造成人免疫性缺陷症的艾滋病病毒、白血病病毒、肉瘤病毒等。在它們的髓核中攜帶反轉錄酶，能使RNA反向轉錄成DNA，豐富和發展了分子生物學的中心法則。它們的複制有其特有的特點，一是單鍊RNA的基因組必須反轉錄成雙鍊DNA；二是随後這種DNA必須整合到細胞DNA中；三是整合狀态長期持續下去并傳給子代細胞，也可能轉錄RNA，生産子代病毒或使細胞轉化；四是感染細胞不會死亡，分裂不停止。也就是說這類病毒的潛伏期很長，有時可以終身帶毒而不發病。

雙鍊RNA病毒的複制

雙鍊RNA病毒有兩個特點，一是它的基因組為10-12條雙鍊RNA分子；二是它有單層或者多層衣殼，而沒有囊膜。病毒的RNA-RNA 聚合酶存在于髓核中，在該聚合酶的作用下病毒基因組轉錄正鍊RNA，它們自髓核逸出。它們既能作為mRNA，又能作為病毒基因組的模闆。MRNA翻譯結構蛋白，裝配内層衣殼後，正鍊RNA進入，并形成雙鍊RNA。然後又重複上述過程，最後獲得了外層衣殼。

綜上所述，病毒複制的特點表現在：一是利用寄主細胞的物質和能量進行病毒生物大分子的合成；二是複制周期短，繁殖效率高；三是反轉錄病毒的複制方式，豐富了遺傳信息傳遞的中心法則。

負鍊RNA病毒複制

負鍊RNA病毒複制的大緻過程是：首先病毒通過其表面糖蛋白與宿主細胞的特異性受體結合，接着病毒囊膜與細胞漿膜（即通過不依賴于PH途徑）或有酸性環境的核内體膜（PH依賴途徑）融合後釋放病毒核糖核蛋白複合體（RNP）至細胞漿，在轉錄過程中每一mRNA得以合成，而通過複制産生全長反義基因組RNA，使其作為病毒基因組RNA的模闆。很多負鍊RNA病毒在感染細胞的胞漿中複制，而一些正粘病毒和布尼亞病毒在細胞核中複制。新合成的RNP複合體與病毒結構蛋白在細胞漿膜或高爾基體膜組裝，然後釋放新合成的子代病毒。

在動物正鍊RNA病毒的研究上，1996年，Meyers G等構建了豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）基因組全長cDNA克隆，将cDNA克隆體外轉錄後獲得的RNA轉染豬腎細胞後最終産生了有感染性的CSFV，雖然拯救出的帶有遺傳标記的CSFV比野生型生長能力上差一些，但仍具有感染性。這是較早的有關CSFV拯救的報道。此外，有報道首先建立表達T7RNA聚合酶的豬腎細胞系SK6，然後将CSFV基因組cDNA克隆線性化後轉染該細胞系，結果成功拯救出與野生型CSFV生物學特性

一樣的病毒，且病毒的效價比用體外制備轉錄本的方法高200倍，如對cDNA克隆不進行線性化直接用環型重組體進行轉染，則拯救出的病毒效價高20倍。此外，在CSFV疫苗株C株的反向遺傳研究上已有很多報道，其中在對标記疫苗、病毒複制、毒力和宿主特異性等方面都有相關報道。

提取方法

試劑準備

1、TROzlo試劑、氯仿、75%乙醇（0.1%DEPC配制）。

2、塑料器皿需用0.1%DEPC水浸泡。

3、0.1%DEPC水：100mldd水中加入DEPC0.1ml，充分振蕩，37℃孵育12h以上，121℃高壓滅菌20min，于4℃保存。

操作步驟

1、樣品處理

（1）組織：50-100mg組織中加入1mlTROzlo試劑。

（2）單層細胞：加入TROzlo試劑1ml/cm2平闆。

（3）懸浮細胞：處理前洗滌細胞，以防止RNA降解。每5-10×105動物、植物或酵母細胞，或1×107細菌加入1mlTROzlo試劑。

2、将上述樣品于15-30℃靜置5min，使核蛋白充分解離。

3、加入0.2ml（1mlTROzlo試劑）氯仿，蓋緊蓋子，充分劇烈振蕩15s并于15-30℃靜置2-3min。

4、于2-8℃12000g離心15min。離心後樣品分層，上層水相中含RNA，下層有機相中含蛋白和DNA。

5、取上清，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，于15-30℃靜置10min後，在管底會出現膠狀沉澱，即為RNA。

6、于2-8℃12000g離心10min後棄去上清。

7、向沉澱中加入1ml75%乙醇，輕輕混勻。

8、于2-8℃7500g離心5min後棄上清

9、将RNA樣品涼幹（不要徹底幹燥），加入适量DEPC水溶解（可于55-60℃促溶10min）。

注意問題

1、在加入氯仿之前（第1步），樣品能于-60-70℃保存至少一個月。

2、 RNA沉澱（第6步）在75%乙醇中于2-8℃能保存至少一周，于-5-20℃能保存至少一年。

3、 RNA定量

RNA（mg/mL）=40×OD260×稀釋倍數（n）/1000

RNA純品OD260/OD280=2.0

RNA電泳

（1）用1×TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，加1×TAE電泳緩沖液至液面複蓋凝膠。

（2）在超淨工作台上，用移液器吸取總RNA樣品4μl于封口膜上。在實驗台上再加入5μl1×TAE電泳緩沖液及1μl的10×載樣緩沖液，混勻後，小心加入點樣孔。

（3）打開電源開關，調節電壓至100V，使RNA由負極向正極電泳，約30min後将凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察RNA電泳結果。

裝配與釋放

新合成的病毒核酸和病毒結構蛋白在感染細胞内組合成病毒顆粒的過程稱為裝配（Assembly），而從細胞内轉移到細胞外的過程為釋放（Release)。大多數DNA病毒，在核内複制DNA，在胞漿内合成蛋白質，轉入核内裝配成熟。而痘苗病毒其全部成份及裝配均在胞漿内完成。RNA病毒多在胞漿内複制核酸及合成蛋白。感染後6個小時，一個細胞可産生多達10，000個病毒顆粒。

病毒裝配成熟後釋放的方式有：⑴宿主細胞裂解，病毒釋放到周圍環境中，見于無囊膜病毒，如腺病毒、脊髓灰質炎病毒等；⑵以出芽的方式釋放，見于有囊膜病毒，如疱疹病毒在核膜上獲得囊膜，流感病毒在細胞膜上獲得囊膜而成熟，然後以出芽方式釋放出成熟病毒。也可通過細胞間橋或細胞融合鄰近的細胞。

病毒的增殖不隻是産生有感染性的子代，絕大多數動物病毒在大量感染的情況下，經多次增殖會産生缺損幹擾顆粒（Defective interfering particles），它是能幹擾親代病毒複制的缺損病毒，其核酸有部分缺損或被宿主DNA片段替換。缺損幹擾顆粒的基本特性是：

⑴本身不能繁殖；

⑵有輔助病毒存在時方能增殖；

⑶幹擾同種病毒而不幹擾異種病毒的增殖；

⑷在感染細胞内與親代病毒競争性增殖。由于缺損幹擾顆粒的産生，使同種感染性病毒數量減少，在導緻病毒的持續性感染中具有一定的作用，但疫苗中含有大量缺損幹擾顆粒會影響活疫苗的免疫效果。

遺傳學研究

近年來，在分子病毒學研究領域興起一門新型技術，即在RT-PCR和體外轉錄RNA技術基礎上建立起來的全長感染性cDNA克隆技術，也叫反向遺傳操作技術（reverse genetics manipulation ），又名“病毒拯救（rescue of virus）”，它解決了對病毒基因組RNA難以操作這一難題。從cDNA克隆拯救出負鍊RNA全病毒是90年代分子病毒學研究領域最振奮人心的突破之一，它開啟了人們對病毒基因組進行人工操作以及詳細了解病毒基因及其産物功能的大門。該技術發展迅速，倍受國内外研究者關注。

與經典的從表型改變到進行基因特征研究的思路相反，反向遺傳操作技術是指通過構建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進行體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項技術。由于最終“拯救”出的RNA病毒來源于cDNA克隆，因此，可通過中間過程中人為加入的DNA環節，在DNA水平上對RNA病毒基因組進行各種體外人工操作，如進行基因突變、基因敲除（缺失）、基因插入、基因置換和基因互補（即構建嵌合病毒）等改造，以此來研究RNA病毒的基因複制和表達調控機理、RNA編輯和自發重組與誘導重組、病毒與宿主間的相互作用關系（如插入報告基因來研究病毒在宿主細胞間的傳遞機制）、抗病毒策略、基因治療研究以及構建新型病毒載體表達外源基因和進行疫苗的研制等。

1976年Goff S.P等首先報道成功拯救出SV40DNA病毒突變株，雖然拯救出的不是RNA病毒，但這是最早的有關病毒拯救的報道。1978年，Taniguchi T等報道從全長cDNA克隆拯救出在細菌中有感染性的Qβ噬菌體。接着，基因組長約150kb的單純疱疹病毒和長約190kb的痘苗病毒的重組病毒的成功拯救及有關研究是病毒學研究的領域重大突破。為在早期反向遺傳操作體系的建立奠定了基礎。

區别

RNA和DNA病毒都能引發肝炎，丙肝由RNA病毒引起，而乙肝由DNA病毒引起。

丙肝病毒疫苗的研制“瓶頸”出現在RNA病毒的形态上面。DNA形态通常比較穩定，因此，任何依次，DNA病毒的複制，都與“原版”DNA高度一緻，因此可以研制出許多用于預防乙肝病毒疫苗。與此相反，RNA病毒在複制過程中會發生錯誤的“拼寫檢查”，RNA病毒的變異速度比DNA病毒快100萬倍，而且體形經常改變。這就使得丙肝等RNA病毒的疫苗研制很難。即使某天研制出丙肝病毒疫苗，每年還是要根據新出現的變異丙肝病毒不斷研制新的疫苗。

丙肝變幻莫測，對人類健康危害極大，我們怎樣才能保護自己免受丙肝的感染呢？最佳方法就是盡早了解RNA緻命病毒的本質，及其感染和傳播的原理。進行早期診斷和治療也非常必要，判斷是否感染丙肝的唯一辦法是做丙肝測試，以确保在病毒侵害肝部之前進行治療。專家們建議，在丙型肝炎高危人群中進行丙型肝炎抗體檢查刻不容緩。有輸血史或是用靜脈注射毒品、多個性夥伴者，以及經常和血液接觸的醫護人員，美容師，牙醫，警察等都因該考慮接受丙肝檢查。

病毒示例

80多年前有一個至少在全球造成2000萬人死亡的兇手，它還從未接受正義的審判，它就是著名的“西班牙流感病毒”。科學家相信，研究惡貫滿盈的1918年“西班牙流感”可能有助于人類防範另一場災難性流感的襲擊。今天，1918年在人們的記憶中是模糊的。那年，第一次世界大戰以同盟國的戰敗投降而告終。戰争造成了1000多萬人死亡，更多的人流離失所。在經曆了4年之久的慘烈戰争後，人們盼望着和平甯靜的生活。然而就在此刻，一場更大規模的災難使得一次大戰的死亡幽靈相形見绌。這場在很多曆史書中隻是一則小小腳注的災難，就是所謂的“西班牙流感”。

最危險的感冒

“西班牙流感”也被稱作“西班牙女士”（SpanishLady），不過它卻有些名不符實。首先，它似乎并不是從西班牙起源的。其次，這場流感絕對沒有它的名稱那樣溫柔。現有的醫學資料表明，“西班牙流感”最早出現在美國堪薩斯州的芬斯頓（Funston）軍營。1918年3月11日午餐前，這個軍營的一位士兵感到發燒、嗓子疼和頭疼，就去部隊的醫院看病，醫生認為他患了普通的感冒。然而，接下來的情況出人意料：到了中午，100多名士兵都出現了相似的症狀。幾天之後，這個軍營裡已經有了500名以上的“感冒”病人。在随後的幾個月裡，美國全國各地都出現了這種“感冒”的蹤影。這一階段美國的流感疫情似乎不那麼嚴重，與往年相比，這次流感造成的死亡率高不了多少。在一場世界大戰尚未結束時，軍方很少有人注意到這次流感的爆發———盡管它幾乎傳遍了整個美國的軍營。

随後，流感傳到了西班牙，總共造成800萬西班牙人死亡，這次流感也就得名“西班牙流感”。9月，流感出現在波士頓，這是“西班牙流感”最嚴重的一個階段的開始。10月，美國國内流感的死亡率達到了創紀錄的5%。戰争中軍隊大規模的調動為流感的傳播火上澆油。有人懷疑這場疾病是德國人的細菌戰，或者是芥子氣引起的。這次流感呈現出了一個相當奇怪的特征。以往的流感總是容易殺死年老體衰的人和兒童，這次的死亡曲線卻呈現出一種“W”型———20歲到40歲的青壯年人也成為了死神追逐的對象。到了來年的2月份，“西班牙流感”迎來了它相對溫和的第三階段。數月後，“西班牙流感”在地球上銷聲匿迹了。不過，它給人類帶來的損失卻是難以估量的。科學家估計，大約有2000萬到4000萬人在流感災難中喪生。相比之下，第一次世界大戰造成的1000萬人死亡隻有它的1/2到1/4。據估計，在這場流感之後，美國人的平均壽命下降了10年。

善化裝兇手

作為一種傳染病，流感至少已經有了2000多年的曆史。1918年“西班牙流感”的危害甚至超過了中世紀歐洲爆發的鼠疫，與最近20年流行的艾滋病打了一個平手（全球大約有7000萬人感染艾滋病，2000萬人死亡）。流行性感冒是比你想象的更嚴重的疾病。即便流感隻有2.5%的死亡率，如果有10億人感染，那麼後果就是“西班牙流感”這樣的災難。流感的另一個危險之處是它的不穩定性：今年你患上了流感，你得到了一定的免疫力。但是你可能仍然逃不過明年的那場流感。相比之下，風疹或者天花之類的傳染病隻要患過一次就能獲得終身的免疫力。

流感病毒的結構決定了它總是能侵害你。流感病毒的遺傳物質是單鍊的核糖核酸(RNA），而不是你我身體中的遺傳物質DNA。有兩種蛋白質像大頭針一樣“紮”在流感病毒的蛋白質外殼上，一種叫做血凝素（HA），另一種叫做神經氨酸酶（NA）。HA和NA的作用是負責讓病毒———準備入侵細胞的和已經在細胞内複制、組裝好的———順利進出細胞。人體的免疫系統也正是以HA和NA作為“靶子”。如果指導HA和NA合成的流感病毒RNA發生了變化（這種變化發生的可能性要比DNA變化的可能性大），那麼人體免疫系統就對改變了結構的HA和NA“視而不見”。直到流感痊愈，你終于獲得了對新的HA和NA的識别能力，不過很不幸：下一次流感病毒的HA和NA可能又變得讓你的免疫系統無法識别了。迄今為止已經發現了15種HA和9種NA。科學家使用HA和NA區别各種流感病毒的身份，例如1968年的“香港型”流感被稱作H3N2。

盡管大多數人可能不知道或者早已忘記1918年的“西班牙流感”，科學家卻一直保持着警惕。弄清85年前的那場災難的原因有助于防止悲劇的重演。尋找将近一個世紀之前的疾病的病因并不是一件簡單的事。直到1930年代，人類才分離出流感病毒。1950年代，美國曾經組織了考察隊趕赴阿拉斯加挖掘死于1918年“西班牙流感”的病人的屍體，期望得到可供研究的病原體。很遺憾，那些埋葬在永久凍土帶的屍體因為解凍腐爛而失去了研究價值。

直到1997年，美國軍事病理研究所的病理學家陶本伯傑（JefferyTaubenberger）領導的一個研究小組才第一次找到造成“西班牙流感”的感冒病毒RNA片斷。陶本伯傑所在的研究所保留了将近一個世紀以來病人的組織樣本，包括一些浸泡在福爾馬林中的“西班牙流感”病人的肺組織。在28份當年的樣本中，隻有一位21歲士兵的肺部樣本完全符合當時“西班牙流感”的狀況。正是在這份标本中，陶本伯傑用逆轉錄聚合酶鍊反應的方法找到了9段當年流感病毒的RNA“碎片”。RNA比DNA更容易分解，但是陶本伯傑發現的RNA片斷已經能夠提供一些“西班牙流感”病毒的線索了。這9段RNA片斷分屬5個不同的基因，其中包括制造HA和NA的基因。

通過比較，陶本伯傑發現造成“西班牙流感”大流行的病毒與豬流感有相似之處，如果把它歸類，那麼它應該是H1N1型的。此前的理論認為，造成1918年流感大流行的病原體，可能是一種禽流感。2001年，澳大利亞的科學家吉布斯(MarkGibbs）在陶本伯傑的基礎上有了進一步的發現。吉布斯把1918年流感病毒中負責制造HA的基因與30種類似的豬流感、禽流感、人類流感病毒中的相同基因進行對比，結果發現了一個很有趣的現象：在這個基因的前部和後部是人類流感病毒的編碼，而在基因的中段則是豬流感病毒的編碼。吉布斯認為，造成1918年全球流感大流行的原因，就是豬流感病毒的一段編碼“跳”到了人類流感病毒的RNA中。

繼續追蹤

然而，也有一些科學家認為吉布斯的證據不夠充分。他們認為，這種人類流感病毒的HA基因和豬流感病毒的HA基因“混合”（科學家稱之為“重組”）的可能性不大。陶本伯傑更是認為，吉布斯“錯誤理解”了他的數據。

要完全認識“西班牙流感”為什麼如此兇惡，可能需要測出它的基因組的全部序列。一些科學家正在試圖挖開更多的死于1918年流感的人的墳墓。倫敦的瑪麗王後醫學院教授奧克斯福德（JohnOxford）就是其中之一。去年，他打算從伯恩(PhyllisBurn，一位住在倫敦南部的20歲的女性）的屍體中采集肺部樣本。伯恩當年因“西班牙流感”而去世，她被安葬在一個灌滿了酒精的密封鉛制棺材中。牛津相信，在伯恩的體内保存有完好的“西班牙流感”病毒。重新調查“西班牙流感”有一定的危險性。科學家建議在生物安全性最好的實驗室中進行研究，以免“西班牙流感”病毒———假如真的能完整找到的話———洩漏出實驗室，再度危害人類。不過相比之下，大自然才是終極的“生物恐怖分子”。研究表明，野生的水禽是感冒病毒的“基因庫”———它們擁有全部15種HA基因和9種NA基因。而豬由于既能感染水禽身上的流感病毒，又能感染人類流感病毒，它很可能會成為一種病毒的“混合器”，即産生了擁有新的HA和NA的流感病毒。這樣一來，人類的免疫系統就可能面臨一場像1918年那樣的嚴峻考驗。

數十年來，世界衛生組織(WHO）在全世界系統地監視人類流感病毒的變化趨勢，但是對于豬流感，卻沒有一個很好的監視系統。今年2月份，在WHO的一次關于流感疫苗的會議上，病毒學家韋伯斯特(RobertWebster）提議，WHO應研制儲備針對所有15種HA的疫苗，以防止類似1918年“西班牙流感”的出現。科學家們還在繼續追蹤“西班牙流感”。用陶本伯傑的話說，80多年前這個惡貫滿盈的兇手，還從未接受正義的審判。