優點
與篩庫法相比較：
1）此方法是通過PCR技術實現的，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時間内獲得有利用價值的信息。
2）節約了實驗所花費的經費和時間。
3）隻要引物設計正确，在初級産物的基礎上可以獲得大量的感興趣基因的全長。
實驗室現有的RACE試劑盒的簡介
™RACE是一種從一個相同的cDNA模闆進行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法會産生較少的錯誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常适合長鍊PCR。
™使用此方法的要求是必須知道至少23－28個核苷酸序列信息，以此來設計5’末端和3‘末端RACE反應的基因特異性引物（GSPs）。
引物的設計：
基因特異性引物（GSPs）應該是：
™23－28nt
™50－70%GC
™Tm值≥65度，Tm值≥70度可以獲得好的結果
需要實驗者根據已有的基因序列設計5‘和3‘RACE反應的基因特異性引物（GSP1和GSP2).由于兩個引物的存在，PCR的産物是特異性的。
反應中涉及到的一些事項
™cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會很高。
™RACE PCR的效率還取決于總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。
™在進行5‘和3’RACE PCR的時候應該使用熱啟動。
™表4中給出了所有引物的相互關系。重疊引物的設計會對全長的産生有幫助。另外，重疊的引物可以為PCR反應提供一個對照。并不是絕對的要利用設計的引物産生重疊片段。
™引物GSP中的GC含量要在50－70%之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補性的引物序列，否則會産生回折和形成分子内氫鍵。另外，避免使用與AP1互補的引物，尤其是在3‘末端。
如果要用重疊片段來檢測設計的引物，GSp1和GSp2之間至少是100－200堿基。隻有這樣才可以用擴增的産物來鑒定設計的引物是否正确。
™降落PCR可以明顯的增加RACE PCR産物的特異性。在最開始的循環中，退火溫度高于AP1引物的Tm值，可以增加對特異性條帶的擴增。随後的退火和延伸的溫度降回到AP1的溫度，可以進行随後的PCR循環。
™驗證基因特異性引物的對照：
單個引物的陰性對照：隻用一個引物GSP來進行陰性對照。這樣不應該産生任何的條帶。如果可以看到明顯的産物，應該改變循環的參數，或重新設計原始引物。
利用兩個GSPS進行陽性對照：（隻有兩個GSP可以産生重疊的時候才可以采用此步。）為了确定RNA樣品中目的基因确實表達，利用兩個GSP和接頭連接的cDNA來産生陽性對照。可以産生兩個引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個片段，應該重複cDNA的合成，或者從一個不同的組織或細胞來源進行cDNA的合成。
™制備和抽提polyA+RNA
不要使用DEPC處理過的水。
純化完mRNA之後，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質量。哺乳動物的mRNA樣品是0.5－12kb的拖帶，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動物的mRNA應略小
實驗步驟
①cDNA第一條鍊的合成：
ƒ我們建議進行cDNA合成的對照反應，這樣可以對樣品的cDNA的合成進行鑒定。加入各種試劑之後，在水浴中42度保溫一個小時。
注意：在水浴或酒精浴中保溫會減少反應體積，從而降低第一鍊的合成效率。
将管放于冰上，以終止第一鍊的合成反應。
直接進行第二鍊的合成。
②cDNA第二鍊的合成：
第二鍊合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和連接酶。T4 DNA聚合酶的功能是補平dscDNA的末端。我們建議做陽性對照，試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。
ƒ建議進行陽性對照,cDNA的質量取決于制備的polyA+RNA的質量。非哺乳動物樣品的mRNA大約在0.5－3kb之間。
ƒ通過電泳檢測cDNA的産量，與對照進行對比，這樣可以有利于在以後的步驟中對cDNA進行稀釋。
接頭的連接及連接産物的稀釋
ƒ按照程序進行連接反應。
ƒ如果沒有對比樣品和對照的産量，利用Tricine－EDTA buffer制備接頭連接的dscDNA的1/50和1/250的稀釋物，用兩種稀釋物進行以下的RACE PCR反應，直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。
RACE－PCR擴增
·進行5’和3’的RACE－PCR擴增。
·利用以下的程序進行降落PCR反應：
94度30秒
5個循環：94度5秒
72度4分鐘
5個循環：94度5秒
70度4分鐘
20－25個循環：94度5秒
68度4分鐘
注意：
我們建議使用降落PCR反應，這就要求GSP的Tm值≥70度。
當循環結束時，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個管中的産物5μl，使用适當的分子量marker。
·可以根據你的基因的特異性來設計最理想的循環參數。如果看不到帶或者隻有微弱的帶，在68度多加5個循環。最佳的延伸時間取決于擴增條帶的長度。如果片斷的長度在2－5kb的時候，經常使用4min，0.2-2kb的時候将延伸時間減到2－3min，對于5－10kb的條帶，延伸時間增加到10min。
③RACE産物的驗證：
{應該對RACE的片段進行驗證,以此來确定是否已經擴增了理想的産物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員，驗證是非常有用的。
有3種驗證RACE産物的方法：
（1）比較由GSP和NGSP獲得RACE産物。
（2）Southern blot
（3）克隆并測序
{我們建議最好測得RACE産物的部分序列。有的時候需要嵌套引物的存在。
比較由GSP和NGSP獲得RACE産物。
{對于5‘末端的RACE産物，比較由AP1和GSP1擴增出來的産物和由AP1和NGSP1擴增出來的産物。
{對于3‘末端的RACE産物，比較由AP1和GSP2擴增出來的産物和由AP1和NGSP2擴增出來的産物。這對于鑒定多條帶是否是上一個PCR的特異性産物是非常有用的。
{如果條帶是正确的，在嵌套PCR反應中的條帶應該是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR産物的遷移率的不同取決于cDNA結構中GSP1和嵌套引物的位置。
④RACE産物的克隆和測序：
{可以利用膠回收試劑盒來回收RACE産物，此試劑盒适合回收2.5kb以下的RACE産物；對于長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最後用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。
{電泳5μl回收的樣品來鑒定回收的質量。
{将回收的PCR産物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位點，将産物克隆到常規載體中
對于5‘端的RACE産物，我們建議挑取至少8－10個不同的克隆以獲得5‘端的最大可能性的序列。（反轉錄并不總是進行到mRNA模闆的5’末端，尤其是長模闆。另外，T4 DNA聚合酶會移走5‘末端的0－20個堿基。）
{一旦鑒定了含有插入片斷的克隆，應該獲得多的序列信息。理想的是，可以對整個開放讀碼框進行測序。包括5‘和3‘的非翻譯區。
全長cDNA的獲得
{通過部分或全部測序鑒定了RACE産物後，可以通過兩種選擇獲得全長的cDNA。
通過PCR的方法。
通過克隆的方法。
通過PCR的方法獲得全長cDNA：
„擴增長的cDNA需要較長的延伸時間，但是如果延伸的時間過長，可以産生拖帶，所以要慎重的設計引物。
„根據從5‘和3‘RACE産物獲得序列信息設計5’和3‘GSP引物。這些引物應該來自cDNA的3’或者5‘的末端，應該是23－28nt長。不應該在引物的末端加上限制性位點，這樣會導緻高背景。在某些時候可以設計3’和5‘的嵌套引物。但是還是應該先利用一對引物進行PCR反應。
通過PCR的方法獲得全長cDNA：
„進行如下的熱循環：
94度30秒
25個循環94度5秒
72度2－15分鐘
„延伸的時間應該等于預期的cDNA長度加上2分鐘。例如：預期得到6kb的條帶，用6+2=8分鐘的延伸時間。
„注意：如果沒有條帶或者條帶弱，增加5個循環；或者優化PCR的條件。
通過PCR的方法獲得全長cDNA：
„在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5μl的樣品。通常情況下，可以見到一條單一帶，如果這樣，利用膠來純化全長的cDNA。
„制備1.2%的TAE buffer制備瓊脂糖凝膠。不使用TBE buffer，TBE的膠很難制備全長的cDNA。
„将剩下的45μl反應物點樣，選用适當的marker。
„利用長波紫外觀察cDNA（≧300nm）切下全長的cDNA。注意：應該盡量減少紫外對cDNA的照射。
通過PCR的方法獲得全長cDNA：
„利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒适合回收2.5kb以下的RACE産物；對于長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最後用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。
„将全長的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆載體中。
通過克隆産生全長的cDNA：
z如果你已經獲得了含有重疊部分的5‘和3’RACE産物，同時在cDNA的重疊部分含有一個酶切位點的話，通過克隆技術可以獲得全長的cDNA。
z利用酶切獲得的3‘和5’擴增産物，并且利用T4DNA連接酶将它們連接起來。利用接頭和cDNA合成引物中的内切酶将最終的全長cDNA克隆到載體中。
z在哺乳動物基因組中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大約106bp才出現一次，因此在絕大多數的cDNA中是不出現的。
Appendix：cDNA接頭和引物z接頭在設計的時候可以使cDNA的擴增成功進行：z接頭的5‘端在第一個循環中沒有AP1引物的結合位點。AP1的結合位點隻有通過GSP的擴增之後才能夠産生。z這些特點中的每一個都可幫助減少cDNA片段擴增過程中出現的非特異性擴增。另外，它們允許從一個複雜的DNA片段的混合物中擴增出靶樣品――所有的産物都有相同的末端結構，因為使用了單一的一套GSPs。
審計程序
RACE (企業實體與環境調查)
這是在實施審計程序時必要的一個程序。
