背景設定
該作中，庫巴帶領小庫巴們襲擊的不是蘑菇王國，而是存分散在蘑菇世界裡的其他七個王國。在各國中，庫巴率領自己的孩子“小庫巴”們去搗亂，導緻各國自古相傳的魔杖被盜取，各國國王被變成了動物及植物等姿态。馬裡奧和路易按順序尋訪各國，幫他們取回魔杖，并恢複各個國王的姿态。但是途中，桃子公主被拐到了位于庫巴總部的第8世界暗黑王國，救回桃子公主則是馬裡奧和路易的最終目标。
角色設定
玩家角色
與前作相同，1P玩家控制的角色是馬裡奧，紅色的帽子和衣服是他的标志；當出現2P的時候則控制路易，綠色的帽子和衣服是他的标志。2P玩家控制路易進行遊戲時，使用各種道具與馬裡奧具有同樣的效果。
變身（能力提升）
超級馬裡奧（即大版馬裡奧）、火球馬裡奧基本與前作相同。小個子馬裡奧狀态下如果直接獲得【スーパーこのは】或【火焰花】的話或變為大版馬裡奧（在世界地圖界面直接使用道具的話，不管大小馬裡奧，會直接完成變身），其他的變身裝道具就算是小個子馬裡奧直接獲取的話，也會直接完成變身。
使用青蛙馬裡奧、浣熊馬裡奧、錘子馬裡奧狀态來通關世界地圖時，通關時的提示信息也會有變化。
其它角色
桃子公主：蘑菇王國的公主。每當玩家通關了一個世界地圖救下國王之後，她會給馬裡奧送來信件和道具。
蘑菇頭：各國國王身邊的侍從。在蘑菇之家，會給玩家提供好用的道具。
國王：統治各國的國王們。由于小庫巴們的惡作劇，國王們被變成了各種姿态。
物品道具
關卡道具
道具分為，在關卡中登場的道具和在世界地圖中已經獲得的道具（地圖道具）。關卡中登場的道具與前作一樣，獲得的話馬上就會生效。地圖道具的話，隻有在地圖畫面上使用了才會生效，無法在關卡中調出使用。但是，能力提升系列的道具，在進入關卡前使用的話，可以對挑戰關卡起到有利作用。
- 關卡中的道具
能力提升系超級蘑菇：撞擊阻礙塊會出現超級蘑菇，并向左或向右移動。取得的話會變身為超級馬裡奧，可以擊碎磚塊障礙。受到傷害的話會回複小個子馬裡奧。
火焰花：撞擊阻礙塊會出現在阻礙塊上方，取得的話會變身為火焰馬裡奧，在超級馬裡奧的基礎上，還可以發射火球。火焰花出現之後，在沒取得之前受到傷害，以小個子馬裡奧取得的話，隻會變身為超級馬裡奧。火焰馬裡奧受到傷害後會回複為小個子馬裡奧（重制版是恢複為超級馬裡奧，以下同樣）。
超級葉子：撞擊阻礙塊會出現超級葉子并緩緩飄落。取得的話會變身為尾巴馬裡奧。在超級馬裡奧能力的基礎上，還會擁有一定時間内可以飛行的能力，緩慢下落的能力，還有可以用尾巴攻擊敵人的能力。浣熊馬裡奧、青蛙馬裡奧、錘子馬裡奧等，取得相應的道具會變身為相應的馬裡奧。（詳細内容前面說過了）
- 其他道具
1UP蘑菇：可以增加1條命的蘑菇，撞擊阻礙塊會出現，并朝着左右一定方向移動。前述的巨大ハテナ阻礙塊中有時也可以一下出來3個。通常是綠色，但不知是否是由于FC機能的顔色上限問題，有時會顯示為白色或者紫色。
超級星星：取得可以使馬裡奧在一定時間内處于無敵狀态，撞擊阻礙塊的會回出現，并跳躍式前進。無敵時間比前作要短。無敵狀态的時候，小個子馬裡奧以外的狀态跳躍的話，會翻跟頭。并且，翻跟頭的時候是無法進入倒立管道的。用無敵狀态來撞擊阻礙塊有時還會出現無敵星星（非無敵狀态下撞擊隻會出現金币），這種稱作隐藏星星或者連續無敵星星，此種情況多處出現在無敵時間馬上就要結束的情況下才能到達地方。也有的關卡要必須連續吃到無敵星星才能通關。
P開關（開關阻礙塊）：寫有P字的開關按鈕。踩上去的話，在一定時間内特定的阻礙塊和黑色無敵花會全部變為金币，金币會全部變為阻礙塊。有時在什麼都沒有的情況下，踩下開關也會出現金币和隐藏的門，ベルトコンベアー也會停止。在生效時間内，ハテナブロック和彈跳阻礙塊等各自的特點，以及地形的變化都會停止。
鞋子：隻有在第五世界第3關中才能取得的能力提升道具（詳情參考前述）。
寶箱：通常會在與錘子怪戰鬥勝利之後出現，也會出現在關卡中特定的位置（關卡中的寶箱基本都是隐藏道具）。這種情況下打開寶箱的話，會無條件通關。
地圖道具
在蘑菇屋或者擊敗錘子怪時打開的寶箱中獲得，或者在通關世界地圖時獲得，會存儲在世界地圖下方的道具欄中。最大可存放28個，如果繼續獲得的話，最新獲得的道具會覆蓋掉最早獲得的道具。隻有在世界地圖頁面才可以使用此種道具，無法在正在挑戰的關卡中使用。在地圖頁面按B鍵可以打開道具欄，使用的話即刻生效。如果在地圖畫面使用了超級蘑菇或者變身裝備等道具，那麼再進入關卡的話，直接就以此種狀态開始挑戰關卡。
除了通常的道具，還存在隻有在地圖畫面才會使用生效的特殊道具。
- 雲彩：使用的話，可以在未通關某一關卡的情況下直接跳過該關卡。跳過關卡之後，如果在接下來的關卡中挑戰失敗，那麼會回到跳過關卡之前的一個關卡，如果想再次跳過，那隻能通過該關卡才可以。此外，雲彩對于地圖畫面上的錘子怪類或者食人花類等無法直接穿過。在第二世界、第五世界中通關飛空艇關卡會無條件獲得。還可以在地圖畫面中通過擊敗錘子怪可以獲得。在第三世界第7關卡中，在獎勵關卡的最後出現，獲得的話會無條件通關。音樂盒：一定時間（回合數）内使背景音樂變化，世界地圖删的錘子怪和食人花等進入睡眠狀态。此時就算碰觸他們也不會進入戰鬥狀态。隻是，通過按下A鍵還是可以直接進入戰鬥狀态。通關第三世界的飛空艇關卡可以獲得，也可以通過擊倒地圖上的錘子怪獲得。還會出現在第5世界第1關的隐藏路線中，取得的話會無條件通關。笛子：打開存在于特定關卡中隐藏地點的寶箱會獲得。使用的話會出現龍卷風，會将馬裡奧吹到屬于瞬間移動空間的第9世界，可以根據來時的世界地圖不同而直接穿越到不同的世界地圖。全部共有3個，持有多個的時候在瞬間移動空間使用的話，可以穿越到更加後面的世界地圖。錘子：可以擊碎世界地圖上的岩石，開通近道或者通往獎勵關卡的道路。打敗地圖上的錘子怪可以獲得。超級羽毛：寫有P字的羽毛，使用的話表面看起來與尾巴馬裡奧同樣，但是時刻處于能量蓄滿的狀态，在接下來的關卡中，除非将其通關或者接觸敵人受到傷害，否則可以無需助跑時刻在天空飛行。在世界地圖上，除了外形跟尾巴馬裡奧一樣之外，胸前還多了個P字。通關一個關卡的話，會恢複成普通的尾巴馬裡奧。在第1、4、6世界中通關飛空艇關卡可以無條件獲得，還可以在第1、3、5、7世界中，白色的隐藏蘑菇之家出現的話可以獲得。此外，擊敗地圖上錘子怪以及在第7世界的食人花關卡中可以獲得。在世界地圖使用超級羽毛之後，進入關卡之前再使用其他道具或者進入關卡後取得其他道具，會變身為與之相應的狀态，從而解除超級羽毛的效果。但是如果事先使用超級羽毛，然後在關卡中獲得浣熊馬裡奧變身的情況下，會在浣熊馬裡奧的狀态下依然持續超級羽毛的效果。在第8世界的迷宮區域等飛出規定高度的話，會立即挑戰失敗。船錨：在小庫巴的飛空艇内挑戰失敗的情況下，飛空艇會逃到世界地圖中的其他位置。這個道具的效果就是即使挑戰失敗，飛空艇也不會逃竄。在第2、4、6世界中白色的隐藏蘑菇之家中可以獲得。
場景地圖
關卡結構
關卡的設計結構與前作同樣，在8個大世界地圖中，各自存在複數的關卡，到達最終的第8世界，并打敗庫巴的話就會迎來結局。與以往不同，各個世界中的關卡數量都是不同的，并且除了通常關卡之外還存在有特殊關卡和獎勵關卡等。該作中各個世界的世界觀都有很大差異，與此相對的也設計出了多彩多樣的關卡布局。此外，各個世界地圖也有着對應自己世界觀的名字。
地圖
存在8種世界地圖，每張世界地圖上設置了構成遊戲核心的普通關卡及其他特殊關卡，還有獎勵設施等，按照大富翁遊戲那樣的格子進行部署配置。
普通關卡（動作遊戲）
普通關卡被稱為“路線”，作為“動作遊戲圖标”被配置在世界地圖上。當通關這條路線之後，圖标會變為“已通關圖标”，可以通過此路線。如此這般，不斷将動作遊戲通關，然後到達地圖上的城堡，再打敗小庫巴，被變成動物們的各國國王就會恢複原樣，以此來達成單個世界地圖的通關。接下來就會進入下一個世界地圖，并無法返回前一個世界地圖。在第8個世界地圖的最終城堡中，打敗庫巴之後，就會徹底通關整個遊戲。關于動作遊戲的關卡，基本上需要按照各個路線的編号逐個通關才能到達城堡，但是有的時候會有分歧路線，也就是不一定全部都要按照順序來通關普通關卡有時也能到達城堡，從而通關單個世界地圖。2人遊戲的時候，馬裡奧和路易可以協力通關各個關卡。
地圖上的其他設施
地圖上除了上述的動作遊戲圖标之外，還有以下很多其他設施。
- 蘑菇屋：可以獲得道具的地方。固定存在于地圖之上。從3個寶箱中選擇1個之後可以獲得物品。外觀通常為茶色（第5世界後半和第6世界為藍色），也有紅色的蘑菇屋，紅色的比較容易獲得稀有道具。一旦進入之後就變為“已通關圖标”，無法再次進入。根據訪問場所的不同一般固定為3種道具，但是具體哪個道具存在于哪個寶箱中是随機的。此外，一共存在6個無論選擇哪一個寶箱都會必定獲得一套變身裝備的蘑菇屋。（第2世界的第3個〈=必須先有錘子道具〉，第3世界的第1個必定獲得青蛙裝、第4世界的第1個〈=必須先有錘子道具〉、第5世界的第1個必定獲得浣熊裝、第6世界的第1個合第2個必定獲得錐子裝）此外，滿足一定條件會出現白色的蘑菇屋（重制版為藍色），這裡的寶箱會出現僅有1個的貴重道具。與通常的蘑菇屋不同，一旦碰到便自動進入，一旦進入後便會消失。單數的世界地圖中可以在這裡可以獲得翅膀（パタパタの羽根），偶數的世界地圖中在這裡可以獲得【船錨（イカリ）】。黑桃圖标：通過連連看遊戲來獲得續命蘑菇的事件場所。固定存在于世界地圖上。對上中下三段的牌進行連連看，如果對上的牌是蘑菇那麼獲得2UP，火花的話是3UP，星星的話是5UP。一旦進入就會變為“已通關圖标”，無法再次進入。
N标志的黑桃圖标：通過猜圖遊戲來獲得道具、金币及續命機會的事件場所。每獲得8萬分時，在通關之後，出現于前一個通關過的圖标上。碰到就會自動進入，18張卡片背面放置，需要猜出兩兩一緻的圖案。錯誤兩次的話會退出遊戲，等待下次機會。全部猜對的話，下次會換成新的布局。一共有8種布局。在印有N标志的黑桃牌關卡的神經衰弱遊戲中，存在着背面寫有N字的黑桃标志。這是真正的任天堂生産的撲克牌中黑桃A上實際印刷的标志，在此之上稍加了改動設計。
- 管道：在世界地圖上去相隔較遠的地方時使用。管道中為1個畫面的地下世界（第5世界除外）關卡（沒有敵人），進入管道之後，從另一邊管道出來即可完成移動。并且，管道中也有時間限制，時間到了的話會通關失敗。但是在《超級馬裡奧典藏版》之後的版本中取消了時間限制，隻會顯示為000。封閉之門：存在于世界地圖上有鑰匙孔的大門。打倒小城堡中的BOSS并獲得魔法球之後可以解封對應的地點，可以移動到大門的另一邊。GAME OVER後再接續的話，大門也不會恢複。根據世界地圖的不同，大門消滅之後也可能變為一座橋。在第1世界的小城堡中，就算不拿到魔法球也可以通關小城堡，這種情況下，就算小城堡被通過關了，封閉之門也不會打開。投錘怪（回旋镖怪、火球怪、ヒマン怪）：隻有1個畫面的特殊動作遊戲關卡。在通關某些關卡或者在某些關卡失敗之後，随機出現在世界地圖上。碰到話自動進入戰鬥畫面。戰鬥時，通過撞擊磚塊會出現火球花、1UP（隻有第5世界）、10金币（隻有第5世界）等道具。道具的出現條件根據地圖上投錘怪所處的位置不同而不同。将其擊倒之後，可以獲得寶箱中的道具，但是它不會變成“已通關标志”，隻是單純的消失掉。可以通過“音樂盒（オルゴール）”道具使其進入睡眠狀态從而直接通過。所出現的怪物種類和數量根據各個世界地圖有所不同。根據世界地圖的不同，對戰時的關卡背景也不同，隻有第3世界時，戰鬥背景中有一個身位的水位，小個子馬裡奧的情況下，行動會受影響。寶船：在第1、3、5、6世界地圖中，當所持金币數所有位數相同，且所得分數10位的數字與前面的金币數相同，在這種情況下通關關卡後，特定的怪物将變身為寶船（通關時的剩餘秒數1秒=50分也會加算上去，這點要注意）。如果将這個特定怪物打敗的話，就算滿足條件，也不會出現寶船。寶船上為畫面強制前進的動作遊戲，除了最後出現的兩個回旋镖怪之外不會出現敵人。船上有大量的金币和很多隐藏的1UP蘑菇，并且在打敗回旋镖怪之後還能獲得寶箱。在寶船上挑戰失敗的話，寶船會恢複成原來的怪物，寶船挑戰通關的話，會消失。小城堡：存在于世界地圖中重要位置的動作遊戲關卡。關卡最後的BOSS是笨笨（ブンブン），将其擊敗并獲得魔法球之後燈光會開始閃爍，計算好剩餘時間獎勵後小城堡會崩塌，被封鎖的大門會打開或變成橋梁。根據小城堡的不同，有時會在沒有獲得魔法球的情況下通關小城堡，這種情況下，就算小城堡崩塌了，封閉之門也不會打開。大城堡：各個世界地圖的最終目的地。裡面有着被變為動物或者蟲子的各國國王。首次進入的時候會直接進入飛空艇關卡。重制版中，國王被變身為其他馬裡奧系列的角色。飛空艇移動之後雖然可以再次與蘑菇對話，在2人遊戲的情況下，通關與挑戰失敗時同樣會進行馬裡奧與路易的交替。各個世界國王被變身為：第1世界：犬（重置版：ガラゲーロ）第2世界：毛蟲（重置版：ターペン）第3世界：河童（重置版：ライタ）第4世界：怪獣（重置版：金剛（ドンキーコングJr.））第5世界：鳥（重置版：トンドル）第6世界：アシカ（重置版：鼹鼠（チョロプー））第7世界：火球花（ファイアパックン）（重置版：耀西）飛空艇：庫巴的飛船。為畫面強制滾動的動作遊戲關卡。打敗最深處的庫巴之後會通關世界地圖。首次進入大城堡的時候會馬上開始該關卡，當挑戰失敗後，飛空艇會逃到地圖上的某個位置，當碰到之後，會強制進入關卡。使用隐藏道具【船錨（イカリ）】可以防止飛空艇逃跑。沙漠：隻出現于第2世界地圖中的動作遊戲關卡。在一定區間内會刮起龍卷風，在關卡途中，背景中的太陽也會作為敵人襲擊過來。金字塔：隻出現于第2世界地圖中的動作遊戲關卡。為地下關卡。塔：隻出現于第5世界地圖中的動作遊戲關卡。第5世界分為地面和雲上兩部分，塔作為連接兩部分的關卡被設置在地圖上。雖然塔内部是像小城堡一樣的構造，但BOSS不是笨笨，進入屋頂的管道之後會到達雲上的地圖。并且，從雲上地圖返回地面地圖時隻需進入雲上地圖中的管道即可，不用通過塔的内部。食人花（パックンフラワー）：隻出現于第7世界地圖中的兩處特殊動作遊戲關卡。關卡比較短，但會出現很多食人花和黑色無敵花（ブラックパックン），而且不會出現超級星星等道具。進入最後的房裡會出現寶箱，拿到寶箱就代表通關。與投錘怪一樣，碰到話就會強制進入關卡，使用道具【音樂盒（オルゴール）】的話可以使其進入睡眠狀态來跳過該關卡，通關的話會消失。不會在世界地圖上移動。戰車、戰艦、高速飛空艇：隻出現于第8世界中的動作遊戲關卡，碰到的話會強制進入關卡。固定顯示在世界地圖上，通關的話會消失。炮台（炮彈、炸彈兵）、投镖鼹鼠（プー）・噴火器（バーナー）為主要的敵人及障礙物，難度比較高。在戰車1中，會有回旋镖怪、戰艦、高速飛空艇，在戰車2中會有笨笨在最深處等待。在戰車1中打敗回旋镖怪會得到裝有超級星星的寶箱，并且封閉之門會消失。第8世界中通常關卡比較少，但戰車，戰艦類關卡比較多。迷宮：隻出現于第8世界中的動作遊戲關卡。也被稱為“下水道”。是由5個奇怪的漩渦相連而組成，其中有3個漩渦是關卡。通過的時候根據運氣不同，有可能簡單的直接通過，也有可能随機被一個怪手抓入其中的某個關卡。當被抓入的時候會強制開始關卡。就算沒有怪手抓住的情況下，在任意漩渦上按A鍵也可以直接挑戰關卡。最後的房間中3個關卡共同都有放着道具【スーパーこのは】的寶箱。重制版改為就算把漩渦全部通關之後也可以再次挑戰，隻不過不會再出現怪手。庫巴城：第8世界的最終關卡。與其他幾個世界的大城堡不同，不會進入飛空艇，而是直接開始動作遊戲。在最後的房間（途中有兩種路線分歧）中打敗庫巴之後，會開啟通往結局的道路。
地形
與前作同樣，關卡由磚塊、管道、雲彩等地形構成。擊碎特定的磚塊會出現金币或者道具，這點也是相同。但是變化比前作更加多樣化。
- 阻擋物·落腳地木塊：木制的阻擋物，可以踩踏但是無法破壞。有的木制阻擋用旁邊撞它的話，它會反彈，有的還在反彈的同時出現道具。磚塊：跟前作同樣的阻擋物，用超級馬裡奧以上的能力從下向上撞擊的話可以将其破壞。該作中用尾巴馬裡奧從側方抽打的話也可以将其破壞。有的其中藏了金币或道具。該作中新登場了一種外形跟磚塊一樣的敵人。第4世界中有巨型磚塊，無法用尾巴擊碎。白磚塊：白色磚塊阻擋物，跟龜殼一樣可以拿起來，一直拿着過了一段時間會消失。投擲出去撞到敵人會将敵人擊倒，但是撞到管道會牆壁的話不會反彈而是直接消失。也有敵人會用這個當武器。音符塊：畫着4分音符圖案的白色阻擋物，橫向觸碰的話有的會反彈有的不反彈。踩到上方然後時機掌握好再按A鍵的話會進行大跳躍。也有的會彈出道具，從上面踩的話，道具會從下方掉出。前作中的彈簧跳台被取消了，取而代之的就是這個音符塊。超級彈跳塊：橘黃色的彈跳阻擋物，踩到上方然後時機掌握好的話再按A鍵可以進行大跳躍。飛出畫面上方，進入獎勵關卡。巨大ハテナ塊：存在于隐藏房間裡的為普通阻擋物4倍大小的ハテナ阻擋物。裡面裝有大量的1UP蘑菇、變身裝等高級道具。同樣的巨大ハテナ塊中一般是同樣的道具。在第4世界中會大量出現，但是這隻是為了配合第4世界所有阻礙物都巨大的外觀而已，并沒有上述的特點。隐藏阻礙塊：與馬裡奧第一作和第二作一樣，在關卡内會有看不見的隐藏阻礙塊，在隐藏阻礙塊的下方，向上方穿過的話，會使其出現。有時裡面會出現金币和道具。并且，隐藏阻礙塊未出現的時候，是無法踩上去的。有時隐藏阻礙塊隐藏的也可能是音符塊或者超級跳躍塊。半接觸地形：長方形面闆的落腳地，其四角邊緣為圓形且在四角上加了釘子設計。顔色有膚色、白色、水色等各種顔色，存在于大量關卡中。從下向上跳躍的話可以穿透。在白色的落腳地上下蹲持續5秒的話可以下落到白色背景的背面，可以在一定時間内在背景後面穿行。如果行走在背景裡，那麼不會受到背景外面敵人的攻擊。在飛空艇中是設計為コンテナ。雲塊：單向通行，從下向上跳躍的話可以穿過，但是無法從上向下穿過。冰塊：出現于第6世界中的，腳下會打滑的阻礙塊。有些冰塊中凍着金币或者黑色無敵花，可以用火球将冰塊融化。管道：跟前作一樣是可以兼并作為移動手段的物件。裡面存在食人花。水中關卡的話，會從裡面噴出水流。該作中，橫向的管道中也會出來食人花。此外，開口向下的管道也可以進入了。還存在途中彎曲的管道。細管道也有很多，但是無法進入，有時還會出來黑色無敵花。踏闆木制踏闆：普通的升降梯，懸浮在空中，有單向移動的也有來回移動的，有的踩上去才會移動，有的踩上去會掉下去。旋轉踏闆：由綠色的球作為軸心，并由紅色的球連成一排形成的踏闆。既是落腳地又是障礙物，旋轉時被卷入的話會被彈飛。有的在一定時間内重複旋轉或者停止動作，有的一開始不會旋轉，踩上去就會旋轉。有的會一直旋轉。軌道踏闆：在Athletics關卡中大量存在。沿着軌道移動的踏闆。有的停在軌道的一端，踏上去才開始移動，有的會按照一個方向前進，在軌道盡頭直接掉下。圓圈踏闆：半圓形中空的踏闆，踩上去後開始抖動，幾秒鐘之後會一下落下。在上面持續跳躍或者踩在前端，可以防止其下落。大多設置在沒有落腳地的空中或熔岩上方。不可思議踏闆：繪有箭頭标志的踏闆。馬裡奧踩上去之後會出現同樣形狀的透明踏闆，并開始移動，且方向不變。一定時間後消失。超不可思議踏闆：有感歎号标記，在踏闆上跳躍落地後，會改變踏闆的移動方向。一定時間之後會消失。雲彩踏闆：普通的踏闆，可以從下向上穿過。但是不能從上向下穿過。
其他設置
金币或黑色無敵花有時會凍在冰塊裡，可以使用火球彈将其融化。陷入流沙後會被吸進去。可以通過連按跳躍鍵脫出。基本上被吸入到最下端就會挑戰失敗，但是也存在流沙下面是隐藏房間的情況。在沙漠的特定地點會産生龍卷風。被卷入的話會一定時間内無法操作，并向上向後返回路線，但是如果用助跑沖向龍卷風并跳躍的話，可以實現大跳躍。在空中戰艦及戰車中有時會遇到螺旋踏闆，在上面跳躍的話會使其一點點旋轉向前移動。但是如果不跳躍的話會馬上掉下來。從下向上跳躍穿過的話會使其稍微向後移動一點。掉進熔岩中的話不管馬裡奧處于任何狀态會立即挑戰失敗。碰到小城堡中設置的刺的話，會受到傷害。與熔岩不同，無敵狀态就算碰到也沒事，超級馬裡奧以上的狀态碰到的話不會立即挑戰失敗。小城堡中，牆壁、天花闆、背景等在一定周期時間中，會移動。小城堡中，搭上傳送帶的話會随之移動。可以通過P開關來實現一定時間的停止。進入瀑布的話會被沖向下方。
- 挑戰失敗的主要條件
小個子馬裡奧的狀态下收到傷害。掉進坑穴或者熔岩。（與是否是無敵狀态無關，直接挑戰失敗。以下幾項同樣）被流沙卷入畫面底部。被強制滾動畫面夾到畫面邊緣。被巨大プクプク吃掉。倒計時結束。
傳送
- 與前作同樣，可以通過傳送來快速通關整個遊戲。在該作中設置了傳送專用的地圖，使用隐藏道具笛子可以來到傳送區域，進入相應的管道來達成傳送。傳送空間（表示為第9世界）使用了與同樣世界地圖一樣的視角，且隻存在傳送用的管道，沒有動作關卡及其他要素。傳送空間分為世界地圖2到4、5到7、以及8三個區域。通過1次傳送無法自由地選擇所有的世界地圖。當馬裡奧處在第1世界的時候，使用笛子隻可以傳送到第2~4世界之間的某一個世界。馬裡奧處于第2~6世界的時候使用笛子可以傳送到第5~7世界之間的某一個世界（也就是說在第5或者6世界時，可以逆向傳送到第5世界的開頭位置），當馬裡奧處于第7世界時，使用笛子可以傳送到第8世界。在第8世界使用笛子會回到第8世界開始時的位置。此外，當處于傳送空間的時候，再使用一次笛子，可以直接傳送到第8世界。笛子在遊戲早期階段就可以快速得到兩個，利用這個可以從遊戲早期一口氣傳送到第8世界。在前述的傳送區域中，可以實現從第6世界到第5世界的逆向傳送（在GBA版中，挑戰庫巴之前不可以）。
遊戲機制
關卡機制
基本上是與前作同樣的側面視角的跳躍動作、然後以到達右側某個終點為目的來進行遊戲。大部分的關卡都是橫向從左向右進行的，但是與前作不同，基本上的路線都可以根據前進方向來朝左右兩個方向自由移動。高度為畫面甚至數個畫面的根據前進方向而可以上下方向滾動頁面的關卡也新增了新來。此外比起前作還新增了不管前進方向如何，畫面都會按照一定方向強制移動的新關卡。
各個關卡的終點從旗杆改為了道具盒，觸碰這個道具盒的話可以獲得對應的卡片道具，然後計算剩餘時間獎勵便可達成通關。集夠3個卡片的話可以獲得1UP，當3張卡片的圖案一樣的時候，根據圖案的不同，也可以獲得2UP或更高的獎勵。根據所走路線的不同，有時取代卡片道具盒，會在獎勵關卡或隐藏關卡中獲得寶箱，并以此通關。當獲得寶箱通關時，則不計算剩餘時間獎勵。
能力提升的狀态，也從原來的超級馬裡奧、火球馬裡奧之外，增加了尾巴馬裡奧、浣熊馬裡奧、青蛙馬裡奧、錘子馬裡奧、鞋頭馬裡奧。有些操作隻有對應的狀态下才可以實現。
操作方法
玩家的操作基本與前作同樣，通過十字鍵的左右鍵來移動、下鍵會蹲下、上鍵會攀登、A鍵跳躍、B鍵加速或者發射火球。再此基礎上，該作還增加了如下操作：
- 一直按住B鍵的話可以拿起龜殼等物品。松開B鍵的話，會将所持物朝地面前方抛擲使其滑行移動，其撞到敵人的話，會擊倒敵人。此外，拿着東西将其按在牆壁上的時候，松開B鍵，會直接将所持物作廢掉（擊倒）。在該作中新增了坡道，在坡道上按十字鍵的下鍵，馬裡奧可以從坡道上滑下去。下滑過程中碰到敵人，可以直接将敵人擊倒（根據敵人不同，如果不能擊倒的話将會受到1點傷害）。通過一直按住十字鍵的下鍵（持續下蹲），可以穿透到某些背景的後面從而到達特殊地點。通過B鍵加速持續一定時間後，能量槽上漲，能量槽蓄滿之後可以更加高速地沖刺。在水面遊泳時，按A鍵+十字鍵的上鍵，可以從水面跳起。在倒立管道（反向管道）的下方起跳，當馬裡奧（或路易）的頭部碰到管道時按十字鍵的上鍵，馬裡奧可以進入倒立管道（前提必須是允許進入的管道才行）。當馬裡奧（或路易）和門重疊的時候，按十字鍵的上鍵，可以進入門中。
難易度方面不像前作《超瑪2》那樣的極端高難度，改為了由中盤開始到後半循序漸進的增加難度，“存在減緩難度的道具”、“可以穿越舞台世界”等，導入了很多面向不擅長動作遊戲玩家的新要素。與前兩作相比，舞台數量增加了幾倍，但是卻不存在保存功能。作為補救措施，與前兩作一樣，為玩家準備了跳躍舞台的方法，可以通過隐藏物品“笛子”來穿越到自己想要玩的舞台。
雙人遊戲
在雙人遊戲中，1P是馬裡奧，2P是路易，來交替進行遊戲。隻是與前前作不同的是，不隻是某一方挑戰失敗的時候會交替，通關的時候也會進行交替。
某一方通關的關卡會在地圖畫面上顯示為已通關關卡，另一方可以直接通過。因此，可以實現兩人共同完成整個世界地圖的通關。
GAME OVER時的續命操作中，可以由各玩家獨立操作。續命的話，該玩家已經通關的關卡會重新恢複成挑戰關卡，如果想通過，必須再次将其通關才可以。非續命，正常進行中的玩家所通關的關卡，開通的大門以及橋梁，還有地圖道具等都不會有變化。蘑菇之家和黑桃卡牌關會複原，因此與舊做相比會更加容易。
存在隻有雙人遊戲時才出現的迷你遊戲。遊戲内容與《馬裡奧兄弟》類似，與原作相比規則稍有不同，兩個玩家相互競争看誰取得更多的金币或擊倒更多敵人。在世界地圖上，當馬裡奧和路易兩人的位置重疊時，任意一方按下A鍵的話會開始迷你遊戲。當某一方倒下，或者兩者相加共同擊敗5個敵人時，擊倒敵人數量多的一方獲勝，勝利的一方會獲得繼續進行遊戲路線的權利，失敗的一方會回到世界地圖上按下A鍵那一方原本所在的位置。當某一方無法通關某個關卡，需要交換玩家幫自己通關時，利用該迷你遊戲可以和平地交換遊戲權，待機的一方為了獨占遊戲權，當對方通過自己待機所處的位置時強制按下A鍵可以将堆放卷入迷你遊戲。此外，迷你遊戲中還可以交換各自玩家在通關挑戰關卡時在最後撞出的獎勵卡片。當某一方玩家獲得同樣圖案的3枚卡片時，會立即增加卡片圖案對應的遊戲機會數。實現方法為，迷你遊戲中，踩到對方頭上，被踩的一方會一瞬間僵直無法移動。除了原創的這個《馬裡奧兄弟》迷你遊戲之外，還有其他3種原創迷你遊戲，例如在關卡中看誰能提前比對手獲得規定數量的金币。
BUG
- 第1世界第3關中，從超級音符阻礙塊的右邊沖刺踩上的話，然後直接跳到白音符阻礙塊上的話，會在空中和地面來回交替往來，變得無法操作。SFC版中發生這個問題之後，倒計時還會繼續。Nintendo Switch版中，會在空中死掉。在第3世界，乘船時使用笛子穿越到穿越區域的話，可以從陸地移動到海中。但是一旦入海了就無法再次回到陸地，除非還有1個笛子道具，不然無法繼續進行遊戲。SFC版中，乘船時無法再使用笛子。浣熊馬裡奧的地藏菩薩狀态下，如果穿上クリボー的鞋子的話，會變為灰色的鞋子馬裡奧，雖然可以一直處于無敵狀态移動，但是無法進入管道。想要解除這種狀态的話，可以通過取得葉子變為尾巴馬裡奧，或者等時間結束。使用浣熊馬裡奧進入城堡的時候，畫面切換的瞬間會變為地藏菩薩狀态，有時畫面會卡住。在第3-9、5-1關中，有些地方會使馬裡奧卡在牆裡無法移動，或者上空飛行的畫面變得很奇怪的地方。因此，在SFC重制版和美版中，路線做了部分更改。用無敵馬裡奧來打敗笨笨的話，魔法球會出現在中央，并且上面的問号标志會倒過來。使用超級羽毛飛行超出畫面極限的話，會直接挑戰關卡失敗。此時，沒有馬裡奧從空中掉下來的動畫。無法上下滑動畫面，畫面左右的幅度也會變窄。世界地圖畫面上錘子怪的移動方向和停止位置雖然已經被做好了限制，但是偶爾會發生根據周圍狀況的不同導緻錘子怪無法無法停止移動而在兩點間永遠不停的往返，從而造成無法繼續遊戲的情況。此外，當N字黑桃牌與錘子怪重疊出現在同一個位置的時候，也會導緻遊戲無法繼續進行。在庫巴城的最終區域裡，使用超級羽毛飛過牆壁去掉位于其他道路上的一層，越過那裡的門之後再返回戰鬥的話，庫巴無法吐出火球。SFC版也是同樣問題。在FC版中，根據關卡的不同，有時會發生道具等色調會改變的情況，這是因為FC的機能限制造成的，在重制版中不會再發生。
此外，還存在上述之外的BUG，有些延續到了SFC版中。
遊戲原聲
該作中，随着容量的增加，曲目數量比前作增加了近一倍，還增加了音色的厚重感。關卡的BGM與前作一樣，各個世界都是共通的，但是各個世界地圖的BGM根據各個世界的世界觀不同，做了相應的變化。此外，DPCM産生的打擊樂器的采樣聲音也被應用到了需要使用打擊樂器的部分，從音色和曲調兩方面上，彙聚了多種風格的BGM。大部分的曲子都是新創作的，無敵狀态、地下關卡、音樂盒、結尾的前奏曲、傳送時的笛子音，都是從前作及《塞爾達傳說》開始就計劃安排的曲子。
音樂原聲專輯
遊戲評測
《超級馬裡奧兄弟3》于當年年末商戰前的10月23日發售，雖然首周的銷量并沒有超過100萬份，但這部作品充分顯示了任天堂産品長賣的特征，玩家的口碑相傳使得銷售熱潮持續不退，連續32周穩居銷售榜前10位。
與前作整整隔了兩年之久的該作并沒有辜負玩家們的期待，宮本茂再次打造出一個絢麗的童話世界。庫班又卷土重來，這次他帶着自己的兒女們不但綁架了公主，還世界各國的國王都變成了動物。不用說馬裡奧義不容辭的又擔當起了救世主。由于這次要到世界各地冒險，而且庫班也配備了大炮、坦克等武器，旅途的艱辛自不用說。不過沙漠國、冰之國以及各地的風土人情也讓馬裡奧豐富了經驗，開闊了眼界，對馬裡奧的成長起到了不小的作用。該作出現了世界地圖的模式，玩家可以在各個關卡中反複嘗試，版面内容豐富多彩，人物形象變得更加卡通，馬裡奧第一次展示了自己的飛翔技能。值得注意的是，這是曆史上賣得最好的一款不與某個遊戲終端相捆綁的遊戲 。（騰訊 評）
任天堂這個曠世神作系列的第三作又變成了一款錯終複雜的冒險遊戲。這也是任天堂最具野心的一款遊戲，在這款非線性平台動作遊戲中，玩家可以自主選擇向哪一個世界。遊戲中還充滿令人耳目一新的升級道具，比如青蛙裝可以讓馬裡奧跳得更遠、遊得更快，浣熊裝可以讓馬裡奧發動可愛的尾巴攻擊，或是進行短暫的空中飛行。沒有發放各種特殊道具時，遊戲則專注于自身的關卡設計，把玩家丢進上下左右滾動的關卡，再往裡面塞進一些巨大的敵人，比如那隻醜陋的吞食魚。如果玩家能活下來，等待玩家的将是迄今為止所有馬裡奧遊戲中最令人頭痛的一場結局戰。先幹掉庫巴魔王全家，然後再和Boss本人一決勝負，遊戲的每個角落都隐藏着奇思妙想的點子，這就是《超級馬裡奧兄弟3》帶給玩家的樂趣體驗，也正是這款完美的8位遊戲帶領整個馬裡奧系列蹒跚地邁向了16位遊戲時代。（《有生之年非玩不可的1001款遊戲》 評）
