聚丙烯酰胺凝膠電泳:分離蛋白質和寡核苷酸-中文百科頻道

簡介

作用原理：聚丙烯酰胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀态，并依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。聚丙烯酰胺凝膠電泳具有極高的分辨率，範圍覆蓋 10–3,000 bp 的 DNA 片段。

補充信息

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）聚丙烯酰氨凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法。化學聚合以過硫酸铵（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸铵産生自由基，後者引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鍊間産生甲叉鍵交聯，從而形成三維網狀結構。

PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續系統和不連續系統兩大類，連續系統電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續系統中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCl。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HCl。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續性，這是樣品濃縮的主要因素。

作用

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子内和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巯基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS後，分子被解聚成多肽鍊，解聚後的氨基酸側鍊和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。SDS-PAGE一般采用的是不連續緩沖系統，與連續緩沖系統相比，能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始後，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在後面形成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而産生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。

此鑒定方法中，蛋白質的遷移率主要取決于它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。

實驗方法

灌膠

先将膠管（5х90mm）封好底，将配制好的分離膠液灌注入膠管内，約70mm高度（掌握分離膠的高度），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm）。用于隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀察膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。要在确認分離膠徹底凝固後才開始配制濃縮膠。

分離膠凝固好後，倒掉覆蓋在分離膠表面的正丁醇，并用去離子水沖洗一次，倒置吸淨殘留的水。将配制好的濃縮膠液灌注入膠管内（約15mm），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm），用于隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀察膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。膠凝固好後，倒掉覆蓋在膠表面的正丁醇，并用去離子水沖洗一次，倒置吸淨殘留的水，準備加樣。