分子生物學技術:研究動植物的一種技術-中文百科頻道

技術分類

目前，常用的分子生物學技術有如下幾種：

PCR單鍊構象多态性分析

PCR-單鍊構象多态性分析是近年來在基因突變檢測中運用最廣泛的方法之一。PCR-SSCP技術憑借突變可引起單鍊DNA三級構象改變,通過觀察單鍊DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率漂移來判斷突變。樣品經PCR擴增後，其産物經變性後可以産生2條單鍊，如果存在基因突變，哪怕是一個堿基的異常，單鍊的構象也會發生變化，正常與突變的DNA單鍊在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中，可以顯現出不同的帶型，從而确定野生型和突變型，PCR-SSCP分析的主要優點是簡易且敏感性較高。

但是該技術不能确定突變的部位和性質。PCR-SSCP突變檢測敏感性随PCR産物長度的增加而降低，一般用于檢測較小外顯子的突變。有時由于單個核苷酸變化所引起的構象改變很小，用PAGE電泳就可能無法檢出，在PCR産物或待測DNA小于200bp時，PCR-SSCP分析能夠檢測出70%~95%的突變。如果以毛細管電泳代替PAGE，則可大為提高突變檢測的效率。

變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳利用由堿基序列所決定的DNA片段溶解度或變性度的差異，達到分離野生型與突變型DNA片段的目的，該手段分辨率達一個堿基。當DNA雙鍊沿變性劑濃度梯度增加的聚丙烯酰胺凝膠遷移時，DNA分子中解鍊溫度（Tm)低的部分逐漸變性解鍊。一般總是錯配堿基部分的異源雙鍊Tm最低，最容易解鍊，其次是富含AT堿基對的部位，富含GC堿基對的部位Tm值較高所以解鍊較難。

因此，正常DNA雙鍊和異源雙鍊在梯度變性膠中電泳時，異源雙鍊總是先解鍊。将PCR産生的雙鍊DNA在濃度遞增的尿素和甲酰胺變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，當某一DNA片段遷移到變性劑濃度與其最低Tm相當的位置時，該片段低溫解鍊部分的雙鍊打開，部分解鍊導緻DNA遷移速度明顯下降，觀察樣品的遷移率變化即可判斷是否存在變異。DGGE敏感性高，即便異源雙鍊中僅含一個錯配堿基，在電泳時也可分辨其遷移率的改變。DGGE方法的單堿基突變檢出率在DNA片段長度600bp以内可以達到95%。

雙鍊構象多态分析法

雙鍊構象多态分析是利用熒光标記引物，通過PCR擴增出相關的研究片段作為熒光标記參照DNA分子。然後用标記參照物FLR分子與待測PCR擴增片段進行雜交。因為FLR和樣本核苷酸序列相似，雜交反應液中所有DNA的正鍊和反義鍊之間将形成雙鍊結構。隻有與帶熒光标記的FLR分子正鍊匹配的DNA雙鍊，經過電泳後方可被DNA測序儀的激光檢測系統所檢測。

所以可檢雙鍊均有一樣的FLR正鍊，雜交雙鍊的電泳遷移率可能相同，但是由于反義單鍊的差異雙鍊變性程度的差異而最終造成電泳遷移率的不同。不像SSCP技術，DSCA能夠任意操縱變性雙鍊的形成，選用不同的FLR可以達到難分樣本的最佳分離效果。另外，通過調整FLR和樣本待測DNA分子的比例，可專一性增強雜交異質雙鍊信号并減弱純合雙鍊信号。

DSCA技術的優點還在于它依據樣品經過固定檢測儀的時間差，而非相同電泳時間遷移的距離差來判斷突變的有無，這樣就避免了諸如SSCP等技術分析中因遷移速率差異而降低的泳動速度慢的條帶檢測率。另一方面，DSCA的有效檢測片段長度可達1kb。由于激光系統的介入，DSCA的靈敏度和上樣量分别得以提高和降低，不到1秒的泳動差異也足以檢測。該技術已被成功地用于囊性纖維化基因的4種突變，以及HLAÑ型基因中131種等應基因的檢測。

變性-高壓液相色譜分析

變性-高壓液相色譜是利用DNA構型改變檢測基因突變和遺傳多态性的方法之一，其可以檢測單核苷酸多态和可遺傳的突變。實驗主要過程包括PCR擴增待測和正常DNA樣品，将擴增産物變性後再複性，若存在突變，在這一複性過程中可形成異源雙鍊。在部分變性條件下，高壓液相色譜分析可以有效地區分由變異堿基與正常堿基形成的異源DNA雙鍊和正常DNA雙鍊。

由于DHPLC的分辨率可達到1bp/kb，而且操作過程可以全部程序化、大規模化和自動化，使得實驗時間大大縮短，實驗準确率提高，可作為大群體任何基因突變初篩的有力手段，比SSCP有更多的優越性，具有廣泛的應用前景，許多工作都已經證實了DHPLC的敏感性、有效性和準确性。

特異性等位基因擴增

等位基因特異性擴增法是基于PCR技術的一種單核苷酸突變檢測法，是分析已知堿基替代或微小片段缺失和插入型突變的常規技術。在PCR的引物設計中，根據已知突變位點性質在引物3'端或中間設計一錯配堿基，使之僅能與突變型或野生型基因互補而隻擴增突變型或野生型基因。