主要用途
loading buffer的功能主要有兩個。第一,裡邊的指示劑溴酚藍和二甲苯氰FF起到指示的作用,顯示電泳的進程,以便我們适時終止電泳;第二,裡邊的成分甘油可以加大樣品密度,使樣品密度大于TAE,從而沉降到點樣孔中,防止樣品飄出點樣孔。另外,有的Buffer是加有SDS的,一般都會寫明。SDS主要是促使聚合酶變性,因為沒有除盡的聚合酶會結合在DNA雙鍊上影響它的遷移速率。細胞裂解後的裂解液,加loading 100℃加熱,也是為了中止酶促反應,防止提取的蛋白質降解。
制備方法
6×loading buffer 一般配置:
6×Loading buffer:
30mM EDTA
36%(v/v) Glycerol
0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF
0.05%(w/v) Bromophenol Blue
主要用于DNA電泳:
10×Loading buffer:
30mM EDTA
50%(v/v) Glycerol
0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF
0.25%(w/v) Bromophenol Blue
主要用于RNA電泳:
10X loading buffer中僅有色素溴酚藍(Bromophenol Blue)一種染料(濃度0.05%);
6X loading buffer中含色素溴酚藍(Bromophenol Blue)、二甲苯腈藍FF(Xylene Cyanol FF)兩種染料(濃度都是0.05%)
在瓊脂糖凝膠(0.5% ~ 1.4%)中溴酚藍(Bromophenol Blue)約與300 bp的雙鍊線狀DNA的遷移速度相同,二甲苯腈藍FF則與4kbp的雙鍊線狀DNA的遷移速度相等。
6Xloading buffer是用來上樣的;10Xloading buffer是stop buffer,是停止酶促反應的,如果一定要用10Xloading buffer的上樣當然也可以,唯一要注意的是:10Xloading buffer中多了一樣SDS,它會使酶類如taq酶變性,以PCR産物為例,在電泳泳道上會産生一片彌散,如果電泳跑的距離短,和多出來一條帶沒有什麼區别(大概1000bp左右)。
5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法
組份濃度:
250mM Tris-HCl(pH6.8)
10%(W/V)SDS
0.5%(W/V)BPB
50%(V/V)甘油
5%(W/V)β-巯基乙醇
配制量: 5mL
配制方法:
1.量取下列試劑,置于10mL塑料離心管中。
1M Tris-HCl 1.25mL
SDS 0.5g
BPB 25mg
甘油 2.5mL
2.加入去離子水溶解後定容至5mL。
3.小份(500μl/份)分裝後,于室溫保存。
4.使用前将25μl的2-ME加到每小份中。
5.加入2-ME的Loading Buffer可在室溫下保存一個月左右。