cDNA文庫:物種的全部mRNA信息-中文百科頻道

mRNA

制備

動物細胞mRNA的制備

植物細胞mRNA的制備

來源

選用mRNA含量高的組織材料,或通過藥物等方法提高mRNA的含量

完整性

1、mRNA在無細胞翻譯體系指導合成高分子量蛋白質的能力。無細胞翻譯系統(Cell-free translation system)，又叫體外轉錄-翻譯的偶聯系統,因為該系統需要制備無細胞提取物,還有人稱之為"溶胞粗制品翻譯系統"。

無細胞提取物的制備：

用機械的,超聲波的,滲透壓或用适當的去污劑等方法,将細胞溶破,再高速離心出去其質膜與細胞核等.該提取液中含有RNA聚合酶,核糖體,tRNA和能量發生系統.

常見的體外無細胞翻譯系統:

兔網織紅細胞系統。網織紅細胞無細胞核,其合成的蛋白質90%以上為珠蛋白.

缺點:已含有珠蛋白mRNA.可以在該體系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去體系中的珠蛋白mRNA。

麥胚系統用組織搗碎機将麥子搗碎,分離出麥胚.然後将粗制的麥胚加10倍體積的緩沖液與砂子共研磨.23000g離心所得的上清夜稱為S23;将S23分裝,保存于-20°C冰箱中.

利用麥胚系統進行蛋白質翻譯合成研究時,需加的物質與網織紅細胞系統相似.由于該體系無mRNA,所以必須加入mRNA。

優點：适于研究mRNA,活力強,價格低廉等.

缺點：不同制品的活性差别較大,且合成分子量較大(71X105 Dal)的蛋白質時往往提前終止.

2、mRNA在無細胞體系中指導合成目的多肽的能力

3、mRNA分子的大小

哺乳動物mRNA長度為500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間.

4、總mRNA指導合成cDNA第一鍊長分子的能力

利用哺乳動物細胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA

豐度

1)高豐度mRNA

目的mRNA在細胞中的含量占細胞質總mRNA量的50-90%,該類mRNA在合成和克隆cDNA之前不需進一步純化特定mRNA .

2)低豐度mRNA

目的mRNA在細胞中的含量占細胞質總mRNA量的0.5%以下.

5,mRNA的富集方法

典型的哺乳動物細胞含有10,000-30,000種不同的mRNA分子,某些mRNA分子在細胞内的拷貝數很低甚至隻有一個拷貝.

mRNA的豐度與文庫克隆子數的關系

ln(1-P)

N=n(1-1/n)

N:所需克隆數;P:要求的概率;n:一種mRNA在總mRNA中的相對比例

1)按大小對mRNA進行分級分離

通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子,該方法的分離效果最好,但從凝膠中回收的得率較低.

蔗糖梯度離心:加入破壞RNA二級結構的變性劑如氫氧化甲基汞等,再進行蔗糖梯度離心以分離不同分子量的mRNA.

2)cDNA的分級分離

mRNA通過反轉錄形成cDNA,在插入到克隆載體前,通過瓊脂糖凝膠電泳,将不同大小的cDNA分子分離開來.

優點:

a)避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解

b)增加了獲得全長cDNA克隆的概率

c)獲得更準确的分級分離效果(分子量)

3)多聚核糖體免疫學純化法

使用抗體來純化合成目的多肽的多聚核糖體.将正在合成的新生多肽鍊的多聚核糖體結合到免疫親和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随後用EDTA将多聚核糖體解離下來,并通過Oligo(dT)層析分離mRNA,利用該方法可将目的mRNA純化數千倍.目的mRNA在細胞中的含量可為數十拷貝.

分離

1.Oligotex mRNA Kits(QIAGEN）法

準備工作：

1.将Oligotex Suspension置于37℃水浴中，旋轉混勻，溶解Oligotex.,然後置于室溫。

2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋轉混勻，重溶沉澱物，然後置于室溫。

3.将OEB Buffer置于70℃水浴中，待用。

試驗步驟：

1.Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml離心管中，加RNase-free water 補足到500ul

2.根據表3加入适當體積的OBB Buffer和Oligotex Suspension，輕彈1.5ml離心管徹底混勻

3.置于70℃水浴中3min

4.取出置于室溫（20℃－30℃）10min

5.13000rpm室溫離心 2min，用移液器吸出上清到一個新的1.5ml離心管中，保留上清直到polyA被結合上。

6.用移液器取400ul OW2 Buffer混勻沉澱物，将混合物轉移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，離心1min

7.将Spin Column 轉移到一個新的1.5ml離心管中，加400ul OW2，RT， 13000rpm，離心1min

9.取出25ulOERBuffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次樹脂，室溫 13000rpm，離心1min。

10.測OD,并電泳定量。

2.磁珠法分離mRN

1.在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的總RNA和RNase-free水至終體積為500ul.

2.65ºC加熱10分鐘。

3.加入3ul生物素标記的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，輕輕混合，室溫放置逐漸冷去至室溫，一般需10 分鐘左右。

4.同時配0.5×SSC1.2ml和0.1×SSC1.4ml.

5.将磁珠（SA-PMPs）輕晃散開，放入磁性分離架上，使SA-PMPs集中于管的一側（約30sec），小心去上清，切不可離心。用0.3ml0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分離架集中磁珠，去除上清，重複3次。

6.将漂洗後的SA-PMPs重新懸浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗後的SA-PMPs應在30分鐘内使用。

7.将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反應物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，輕輕搖勻，室溫下放10分鐘。

8.用磁性分離架捕獲SA-PMPs,小心去上清，但不要棄去。

9.用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs懸浮，最後一次漂洗後盡可能多的吸取水相，而不損壞SA-PMPs.

10.将SA-PMPs重新懸浮在0.1mlRNase-free水中，反複颠倒，使SA-PMPs散開，洗脫mRNA。

11.用磁性分離架捕獲SA-PMPs,将洗脫的mRNA吸入另一個新的Eppendorf管中。

12.将SA-PMPs再懸浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脫，與（11）步洗脫液合并。

13.将得到的mRNA溶液取幾微升跑電泳，若mRNA濃度不足以進行下一步的反轉錄，則需将得到的mRNA溶液濃縮（濃縮步驟見14-18）。

14.加0.1體積的3mol/lNaAc和1.0體積的異丙醇于洗脫液中，-20ºC沉澱過夜。

15.4ºC，13000g離心60分鐘。去上清，加入500ul70%乙醇混勻。

16.4ºC，7500g離心10分鐘。

17.去上清，真空或空氣中自然風幹，但不要太幹，加适量RNase-free水溶解。

18.重複步驟5-12，将步驟8保留下的樣品重新上柱

注意事項：

1．所有操作均需要嚴格戴手套，戴口罩進行

2．如果totalRNA質量高，雜質少，就選擇Oligotex的方法分離mRNA，相反則可以用磁珠法。

3．mRNA的電泳圖是smear。

TRNA

TRNA提取

試劑配制

準備工作：

1、研缽、5ml/10ml/25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、藥匙、試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小時。

2、50ml/1.5ml離心管、槍頭等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡過夜後，121℃ 20mins高壓滅菌。

3、電泳槽及電泳托、梳子用3%雙氧水處理。

4、常用試劑及其配方：

DEPC水：在1000ml去離子水中加入100ulDEPC,靜置過夜後高壓滅菌。

0.78M檸檬酸納：PH=4~5

三水合檸檬酸納22.94g

加DEPC水定容至100ml，室溫放置備用。

10%肌氨酸鈉：

肌氨酸鈉10g

加DEPC水定容至100ml，室溫放置備用。

變性裂解液：

0.78M檸檬酸鈉8.25ml

10%肌氨酸鈉12.375ml

異硫氰酸胍118.05g

加DEPC水定容至250ml，室溫放置備用

臨用前加β-巯基乙醇使其終濃度為1%（v/v）

2M醋酸鈉 PH=4.5

NaAc·3H2O13.6g

加DEPC水定容至50ml,高壓滅菌，室溫放置備用

3M醋酸鈉PH=5

NaAc·3H2O20.4g

加DEPC水定容至50ml,高壓滅菌，室溫放置備用

4MLiCL:

LiCL24.164g

加DEPC水定容至100ml,高壓滅菌，室溫放置備用

0.5MEDTAPH=8.0

EDTA18.61g

用NaOH調PH值至8.0，定容到100ml，高壓滅菌，室溫放置備用

10X MOPS(3-（N-嗎啉代）丙磺酸):

MOPS41.86g

NaAC·3H2O4.10g

0.5MEDTA（PH8.020ml

用NaOH調PH值6.5,DEPC水定容到1L，室溫避光放置備用。

1x MOPS:

10xMOPS30ml

加DEPC水270ml，用時現配。

▲4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油（高壓過） 200UL

溴酚蘭 10ul

甲醛(37%) 72ul

去離子甲酰氨310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在4℃ 可保持3個月

10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至 1000ml

▲變性電泳膠：

稱取0.5g瓊脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加熱至瓊脂糖熔化後，冷卻至50℃左右，加入2.5ml甲醛，輕輕混勻後倒入電泳托上。

▲變性電泳緩沖液：

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml

2.動物組織t RNA的提取

1．根據表1選擇适當的組織量和相應的變性裂解液量，将變性裂解液分裝到RNase-free的50ml無菌離心管中，冰浴5分鐘。

2．将組織樣品放入變性裂解液中，在高速下勻漿15-30秒/次，直到看不見組織和細胞碎片。

3．根據表1加入适量2M的乙酸鈉（pH4.0），反複颠倒混勻4-5次。

4．根據表1加入适量酚/氯仿,加蓋颠倒混合4-5次，再搖動10秒鐘。

5．冰浴10分鐘。

6．4°C，12000g離心20分鐘。

7．小心轉移上層水相于另一個RNase-free的無菌離心管中，内含所需的RNA。蛋白質和DNA分别留在了有機相和中間層。

8．加入等體積的異丙醇，-20°C沉澱30分鐘以上。

9．4°C，12000g離心20分鐘。

10．根據表1加入适量的變性裂解液重新溶解RNA。

11．加等體積的氯仿，加蓋颠倒混合4-5次，再搖動10秒鐘。

124°C，12000g離心20分鐘。

13．小心轉移上層水相于另一個RNase-free的無菌離心管中,加入等體積的異丙醇，-20°C沉澱至少30分鐘。

14．4°C，12000g離心20分鐘。

15棄上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉澱。4°C，12000g離心10分鐘。

16．棄上清，空氣中幹燥RNA沉澱，直至沒有乙醇氣味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉澱。

17．取少量RNA用于測定OD值及電泳，其餘置－80°C冰箱中保存。

3.植物組織t RNA的提取

1.先将研缽于－80℃冰箱中預冷，然後将1g樣品在液氮中研磨成粉末狀。

2.将粉末倒入盛有3ml變性裂解液的50ml離心管中，充分勻漿。（1g樣品加入3ml變性裂解液）。

3.加入0.3ml（1/10體積）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混勻。

4.加入3ml（等體積）的水飽和酚，充分振蕩，再加入1ml（1/3）的氯仿，振蕩。

5.冰浴10min。4℃，12000g離心10min

6.小心轉移上清于另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，－70℃沉澱至少1小時。

7.4℃，12000g離心20min。

8.去上清，取沉澱。加1ml 4M的LiCl 溶解沉澱（1mlLiCl/g組織），并轉入1.5ml離心管中。

9.4℃，13000rpm離心15min。

10.用0.4ml DEPC水溶解沉澱，加1/2體積的水飽和酚，1/2體積的氯仿，颠倒混勻。

11.4℃，13000rpm離心10min。

12.取上清，加1/10體積的3MNaAc（ph5）和2倍體積的無水乙醇，－70℃沉澱30min以上。

13.4℃，13000rpm離心15min。

14.棄上清，用1ml 75%的乙醇洗滌沉澱，4℃，13000rpm離心10min。

15.棄上清，取沉澱，空氣中幹燥RNA沉澱，直至無乙醇味。

16.用40－60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉澱。

17.取少量RNA用于測定OD值及電泳，其餘置－80℃冰箱中保存。

4.TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)

1．查表2根據樣品量選擇适當的 TRIzol Reagent體積裝入50ml RNase-free離心管中，注意樣品體積不能超過TRIzol Reagent體積的10%。

2．将組織樣品放入TRIzol Reagent中，高速下勻漿15-30秒/次，直至看不見組織和細胞碎片。

3．室溫溫育10分鐘。

4．據表2加入适量體積的氯仿，劇烈震蕩15秒鐘，然後室溫下溫育3分鐘。

5．4ºC，12000g離心15分鐘，形成淡紅色的苯酚/氯仿有機相，中間相和上層水相，水相約占TRIzol體積的60%。

6．轉移上清于另一個Rnase-free的 50ml離心管中。根據表2加入适量異丙醇，-20ºC沉澱1小時以上。

7．4ºC,12000g離心10分鐘。

8．去上清，據表2加入适量體積的75%的乙醇混勻。

9．4ºC，7500g離心5分鐘。

10．去上清，空氣中幹燥或真空抽幹RNA沉澱，但不要太幹。加入适量體積的DEPC-WATER,溶解沉澱。

11．取少量RNA用于測定其OD值和電泳，其餘置-80ºC冰箱中保存。

合成

cDNA雙鍊合成

1.superscipt II—RT合成第一鍊:

1.在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入

xul mRNA(大約500ng)

1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x ul RNase-free water

（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一鍊, 第一鍊合成完畢後将n管合成一管進行第二鍊合成.）

2.混勻後,70℃反應10分鐘;

3.反應完成後,立刻将反應體系置于冰上5min;

4.稍微離心一下,順序加入以下試劑:

4ul 5×first strand buffer

2ul 0.1M DTT

1ul 10mM dNTP(自己配制)

5.混勻，稍微離心反應物之後,42℃放置2分鐘;

6.反應完成,趁熱加入1 ul Superscipt II—RT,混勻;

7.42℃反應50分鐘,然後70℃,15分鐘滅活反轉錄酶.

2.cDNA第二鍊的合成

1.第一鍊反應完成後,取2ul一鍊産物－20℃冰箱中保存，待電泳檢測。其餘的産物合并，混勻，然後順序加入下列試劑(promega):

20ul 10×DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP(自己配制)

xul dd H2O

1ul RNase H(2U/ul)

10ul DNA Polymerase I(10U/ul)

總體系為200ul;

2.混勻後,16℃反應2.5小時;

3.70℃滅活10分鐘;

4.反應完成後,得到200ul cDNA第二鍊反應體系,将此體系置于冰上;

5．取2ul二鍊産物，同保存的一鍊産物一起電泳鑒定。同時上1kb ladder，确定雙鍊的大小範圍。

注：一鍊，二鍊的電泳圖是smear，且二鍊稍比一鍊大一些。

3.雙鍊cDNA末端補平

1.在第二鍊反應體系中,順序加入下列試劑(promega):

6ul 10mM dNTP

2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)

2ul BSA(10mg/ml)

2.稍微離心混勻反應物, 37℃反應至少30分鐘,然後75℃滅活10分鐘;

3.加入等體積酚/氯仿/異戊醇,劇烈振蕩後,常溫下13000g離心5分鐘;

4.離心後,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等體積氯仿,上下颠倒幾次混勻後,常溫下13000g離心5分鐘;

5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V預冷的無水乙醇,混勻,-20℃放置過夜以沉澱雙鍊cDNA;

6.第二日,将昨日沉澱物在4℃,13000g離心60分鐘以充分沉澱雙鍊cDNA;

7.離心完畢,棄上清,加入1ml 70%乙醇洗滌沉澱,常溫下13000g離心5分鐘;

8.離心完畢,棄上清,幹燥沉澱至無乙醇氣味.

注：第3，第4步可以用PCR 純化試劑盒代替。

PCR純化試劑盒操作流程：

1．溶液PE使用前應加入适量體積95%－100%的乙醇，混勻。

2．向200ul二鍊補平産物中加入5倍體積的buffer PB，混勻。

3．加入spin column中，13000rpm離心1min。

4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm離心1min。

5．13000rpm，再離心1min。

6．将spin column放入一新的離心管中，加入50ul buffer EB，靜置10min。

7．13000rpm離心2min。

8．加入30ul buffer EB，靜置10min。

9．13000rpm離心2min。

10．加入1/10體積3M的NaAc，2.5倍體積無水乙醇，混勻，－20℃沉澱過夜。

4 EcoR I adaptor 加接

1.往雙鍊cDNA沉澱中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉澱;

2.溶解完成後,順序加入下列試劑:

1.2ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)

3.混勻後,4℃連接3days,或者8℃過夜連接;

5雙鍊cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切

1.連接反應完成後,将反應體系70℃放置15分鐘滅活T4 DNA Ligase;

2.稍微離心使反應物集中至管底,室溫下放置5分鐘,然後加入下列試劑:

1ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

6ul dd H2O

1ul T4 PNK(10U/ul)

3.37℃反應30分鐘,然後70℃滅活15分鐘;

4.稍微離心使反應物集中至管底;

5.室溫放置5分鐘;然後加入下列試劑:

4ul Xho 10×Buffer

2ul BSA

5ul ddH2O

8ul Xho I (10U/ul)

6.37℃反應1.5小時,然後65℃滅活酶10分鐘;

7.反應完成,雙鍊cDNA合成完畢。置于4℃準備回收。

6.膠回收cDNA

1．配制小膠數闆（每個樣品一闆）：1%瓊脂糖凝膠，2ul EB/300ml 膠

2．取4℃保存樣品上樣，40ul/孔。

3．電泳50V；1hr

4．紫外燈下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA片段.，分别放入已做标記的1.5ml離心管中。

5．稱取膠重，加入三倍體積buffer QXI（例如，100mg膠中加入300ul buffer QXI）

6．50℃水浴數分鐘，至膠完全融化。用手指彈 QIAEX II 使重懸，每管中加入5ul QIAEXII

7．50℃水浴10min，每隔2min 取出颠倒混勻數次，使QIAEX II 保持懸浮

8．4℃，13000rpm，30sec。（棄上清，離心機中甩一下，吸取上清）

9．加入500ul buffer QXI，輕彈管底使QIAEX II 重懸

10．離心并去上清（同操作8）

11．加入500ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30sec，去上清

12．再加入500ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30sec，棄上清，離心機中甩一下，吸去上清

13．超淨台上吹幹（至無乙醇味），加入10ul elution buffer，重懸QIAEX II，靜置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14．取1ul上清上樣電泳，同時做分子量标準（1kb ladder）及DNA含量标準（10ng，20ng）作對照。

15．将收回的cDNA置于-20℃内保存，據電泳結果，取适量DNA進行連接。

注意事項：

1．膠回收前電泳槽，電泳闆，梳子等都要用1%的HCl浸泡過夜。

2．膠回收時電壓要穩定。

第一鍊

第一鍊的合成

oligo(dT)引導的DNA合成法:

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段,由反轉錄酶合成cDNA的第一鍊.

缺陷:

因為逆轉錄酶無法到達mRNA分子的5'-末端,必須從3'-末端開始合成cDNA.對于大分子量的較長的mRNA分子而言,特别麻煩.

随機引物引導的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :

根據許多可能的序列,合成出6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段(混合物),作為合成第一鍊cDNA的引物.在應用這種混合引物的情況下,cDNA的合成可以從mRNA模闆的許多位點同時發生,而不僅僅從3'-末端的oligo(dT)引物一處開始.

第二鍊

第二鍊的合成

第一鍊的合成反應完成後，得到DNA/RNA雜交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一鍊為模版，合成cDNA的第二鍊。

自身引導

變性降解除去雜交分子中的RNA,單鍊cDNA的3'端能夠形成發夾狀的結構作為引物,在大腸杆菌聚合酶I Klenow或反轉錄酶的作用下,合成cDNA的第二鍊.

缺點:

在以S1核酸酶切割cDNA的發夾狀結構時,會導緻對應于mRNA 5'端的地方的序列出現缺失和重排.S1核酸酶的純度不夠時,會偶爾破壞合成的雙鍊cDNA分子.

自身引導法合成雙鍊cDNA

置換合成

原理:

以第一鍊合成産物cDNA:mRNA雜交體作為切口平移的模闆,RNA酶H在雜交體的mRNA鍊上造成切口和缺口,産生一系列RNA引物,在大腸杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鍊.

優點:a)合成cDNA的效率高

b)直接利用第一鍊的反應産物,不需純化

c)避免使用S1核酸酶來切割雙鍊cDNA

3,引物-銜接頭法

克隆

将合成的雙鍊重組到質粒載體或噬菌體載體上,轉化大腸杆菌寄主細胞增殖.

1,同聚物加尾法

利用小牛胸腺末端轉移酶在雙鍊cDNA和質粒載體的3'-端都加上一個互補的同聚片段,通過退火使兩個片段連接成重組質粒,再将重組質粒轉化受體細胞.

同聚物加尾法克隆雙鍊cDNA

2,接頭-銜接頭法

3,mRNA-cDNA克隆法

方法:

在mRNA反轉錄合成cDNA第一鍊後,将dA殘基加到mRNA:cDNA雜交體上,然後與帶dT尾的克隆載體連接,轉化受體細胞,在宿主細胞内,mRNA被降解并代之以DNA.

缺點:

克隆的效率低(為雙鍊cDNA克隆的1/10)

4,Okayama-Berg法合成并克隆雙鍊cDNA

載體制備

1．pBlueScriptII的提取

1．取1ul商品的pBlueScriptII，轉化入大腸杆菌宿主菌中，取5ul轉化産物均勻塗布在含AMP的LB平闆上，37℃培養過夜。

2．第二天取一隻無菌的50ml離心管，加入10mlAMP抗性的LB液體培養基，挑單克隆于離心管中，37℃，250rpm，培養過夜。

3．第三天取200µl小搖後的菌液接種于250ml含AMP的LB液體培養基中，37℃，250rpm培養6 hr左右，使OD值達到0.6-0.8。

4．将菌液移入250ml離心管中，4℃，3000rpm，離心15min。取出離心管，菌團朝上倒掉上清，将離心管倒置于吸水紙上使上清充分濾幹。（注意離心前需配平）

5．加入10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8．0），加入RNase至終濃度100µg/ml，晃動搖菌，使菌體充分懸浮，靜置10min。

6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鮮配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，靜置3-5min。

注：靜置時間勿超過5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。

8．4℃，5000rpm，離心15min。

9．取上清于兩個50ml離心管中，棄去原離心管中的沉澱。

10．每管加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置10min。

11.20℃，12000g，離心20min回收質粒沉澱。

12．棄上清，用70%的乙醇洗2次。

13．棄上清，倒扣于吸水紙上，盡量空幹液體。

14．用3ml TE（pH8.0）溶解沉澱，移入1.5ml Eppendorf離心管中。

15．電泳檢查DNA質量并定量。（必要的話，可以用膠回收的方法先純化一下質粒再進行雙酶切。）

2．pBlueScriptII的雙酶切消化

1．以如下體系進行EcoRI酶切：

pBSK(+) X µl（6µg）

ddH2O 174-X µl

10×Buffer E 20 µl

混勻，加入限制性内切酶：

EcoRI （10U/ µl） 6 µl

總體積為200 µl。

2．輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機上甩一下。

3．37℃，水浴1hr。

4．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混勻。4℃，13000rpm，離心15min。

5．取上清，加入等體積的氯仿，4℃，13000rpm，離心10min。

6．取上清，加入0.1倍體積的NaAC和2.5倍體積的無水乙醇，－20℃，沉澱30min。

7.4℃，13000rpm，離心10min，棄上清，取沉澱。

8．加入200ul 70%的乙醇洗沉澱。

9．4℃，13000rpm，離心10min，棄上清，取沉澱。

10．自然風幹沉澱，至無乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉澱。

11．加入以下試劑進行XhoI酶切：

ddH2O 74 µl

10×Buffer D 20 µl

混勻，加入限制性内切酶XhoI：

XhoI，（10U/ µl） 6 µl

總體積為200 µl。

12.輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機上甩一下

13.37℃，水浴1.5hr。

14．加入200ul，1:1的酚/氯仿，混勻。

15．4℃，13000rpm，離心15min。

16．取上清，加入等體積的氯仿，4℃，13000rpm，離心10min。

17．取上清，加入0.1倍體積的NaAC和2.5倍體積的無水乙醇，－20℃，沉澱30min。

18.4℃，13000rpm，離心10min，棄上清，取沉澱。

19．加入200ul70%的乙醇洗沉澱。

20．4℃，13000rpm，離心10min，棄上清，取沉澱。

21．自然風幹沉澱至無乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉澱，得到雙酶切載體。

3．載體去磷酸化

1．在40ul雙酶切載體中加入以下試劑：

6ul10×buffer

6ulCIAP（0.01U/ul）

8ulddH2O

總體積60ul。

2.輕彈管壁或用槍頭輕輕吹打混勻，在離心機上甩一下。

3.37℃，水浴1hr。

4．70℃，15min，滅活酶。

5．電泳分離，膠回收雙酶切載體，定量。

4．載體效率檢測

1．作4個連接反應，14℃連接過夜。

2．各取1ul連接産物作電轉化（具體流程見電轉化）

3．計算克隆數，計算載體相對脫磷效率及連接效率。

鳥槍法

又叫霰彈法,其特點是繞過直接分離基因這一關.由于目的基因在整個基因組中太少太小,在相當程度上靠"運氣".

原理:

基因組DNA

物理(剪切力,超聲波等)或生化方法(限制性内切酶)切割

長度與一般基因大小相當的DNA片段的混合物

随機地重組入适當的載體

轉化

大腸杆菌中擴增

适當的方法篩選

要求有簡便的篩選方法:

利用特定基因缺陷型(如營養缺陷型等)的受體細胞,或特定的寡核苷酸DNA片段探針以特定基因産物的抗體,可通過雙表型的篩選或用分子雜交技術,免疫篩選技術檢出目的基因.

示例:面包酵母吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的制取

EcoRI載體

酵母DNA片段基因重組DNA

轉化

"吲哚甘油磷酸脫氫酶型組氨酸缺陷型"大腸杆菌

基本培養基

篩選,分離菌株

目的基因

物化方法

基因工程初始階段所用的方法,已不用.利用核酸雙螺旋之間存在着堿基G C,A T配對特性,分離目的基因.

例如:海膽rDNA分子内其G C含量可以達63%(其穩定性高,溶解溫度高),通過熱變性和S1酶解處理可得到提純50倍的rDNA,最後經氯化铯平衡梯度離心,得到相對分子量為1.9X107Dal的高純rDNA.

從基因文庫中分離目的基因

分離基因

如果手中有足夠量可産生抗體的來源于真核細胞的蛋白質,可以通過雙抗體免疫法分離出此蛋白的基因.

基本原理:

核糖體沿mRNA進行多肽鍊合成時形成多聚核糖核蛋白體,而具有不同長度的新生肽鍊在核糖體上不斷延伸;

将從細胞勻漿液中制備出的多聚核糖核蛋白體同特定抗體一起保溫,形成多聚核糖體同抗體的複合體;

當加入特定蛋白的抗體産生的第二抗體時,産生沉澱,就可以通過不連續蔗糖梯度離心,将所要的含有特定的mRNA的多聚核糖體同總多聚核糖體分離;再通過酚,氯仿抽提去除蛋白及oligo-dT柱親合層析,就可以得到為特定蛋白編碼的mRNA,再通過反轉錄得到cDNA.

化學合成

基因的化學合成

基因片段的全化學合成

首先合成一個基因的所有片段,相鄰的片段間有4—6個堿基的重疊互補,退火後,用T4DNA連接酶将各片段以磷酸二酯鍵的共價鍵形式連接成一個完整的基因.

基因的化學—酶促合成

不需要合成完整基因的所有寡核苷酸片段,而是合成其中一些片段,相鄰的3'-末端有一短的順序相互補,在适當的條件下通過退火形成模闆—引物複合體,然後在存在四種的條件下,用大腸杆菌DNA聚合酶I大片段填補互補片段之間的缺口,最後用T4DNA連接酶連接及适當的限制性内切酶.

白芨是一種重要的中藥材,具有止血、抗菌、抗腫瘤的作用。通過構建cDNA文庫以及采用IlluminaHiSeq測序平台對白芨塊莖進行轉錄組分析。結果顯示,獲得130721條Unigene,經過與NR、GO、KOG及KEGG數據庫進行比較分析後,60827條Unigene獲得注釋。在KEGG代謝途徑分析中,1916條Unigene參與了糖類代謝,185條Unigene參與了萜類和酮類化合物的代謝