核酸适配體簡介
SELEX技術是20世紀90年代初新興并發展的一種體外指數富集配體的系統進化的組合化學技術，能夠有效地用于核酸結構分析與功能研究。核酸适配體(aptamer)是基于SELEX技術從随機寡核苷酸文庫中篩選獲得的對靶物質具有很高特異性與親和力的寡核苷酸序列。人工化學合成一個文庫容量為1014-1015的随機寡核苷酸文庫，其總長度一般為70-100nt，中間包含20-40nt的随機序列。文庫與靶标物質孵育一定時間後形成核酸-靶标的複合物，利用一定的方法除去未與靶标結合的文庫序列，複合物熱解離獲得與靶标結合的序列，并以此為模闆進行PCR擴增，進而制備下一級文庫。經過8-20輪不斷篩選獲得對靶标具有高特異性與高親和力的寡核苷酸序列，即适配體。适配體經克隆測序後獲得相應核酸序列用于後續的研究。
适配體的篩選方法
适配體靶标範圍廣，靶标的大小與可溶性均不同，因此應用SELEX技術篩選核酸适配體可以采用不同的具體操作方法。離心沉澱法常用于針對細胞、細菌與病毒的适配體篩選，固相吸附與洗脫技術可以用于可溶性小分子的适配體篩選。适配體篩選的具體方法包括以下幾個方面。
基于不同固定介質的篩選方法。硝酸纖維素膜過濾法是一種常用于蛋白質适配體篩選的方法。Joshi等基于硝酸纖維素膜設計了一種橫向流動色譜裝置，結合應用該裝置與SELEX篩選技術，作者經過7輪正篩和3輪反篩獲得了針對鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白(Omp)的高親和力适配體33和45序列，檢出限為10-40cfu/mL。凝膠柱亦是适配體篩選常見的固定介質。Tang等基于瓊脂糖凝膠樹脂應用SELEX技術篩選獲得對紅豆毒素具有高特異性與高親和力的适配體，其解離常數低至幾nmoL範圍。近些年來，以微孔闆為固定介質篩選适配體應用廣泛。王立峰等基于微孔闆技術篩選獲得能與癌胚抗原(CEA)特異性結合的高親和力适配體序列，研究表明該适配體在腫瘤早期診斷、監測與治療方面具有重要作用。
熒光磁珠SELEX(FluMag-SELEX)技術。FluMag-SELEX是結合應用磁珠與SELEX技術篩選熒光适配體的一種方法，該方法需要靶标量少且可通過熒光直觀測定結合适配體的量。Kim等應用FluMag-SELEX技術篩選獲得廣譜抗炎性藥物布洛芬的5條特異性适配體。其中三條是外消旋布洛芬的特異性适配體，另外兩條能與外消旋和内消旋布洛芬特異性作用。布洛芬适配體的特異性強，與布洛芬類似物、土黴素均沒有結合作用。Xu等應用FluMag-SELEX技術篩選獲得多氯聯苯的特異性适配體，其解離常數為微摩爾級别，且在0.1到100ng/mL範圍内線性良好。
毛細管電泳SELEX技術(CE-SELEX)。不同組分間的荷質比存在一定差異，導緻物質的電泳遷移率有所不同，從而實現不同組分的分離。CE-SELEX能在2-4輪内實現高親和力适配體的篩選，常被用于篩選蛋白質、脂多糖、多肽等大分子物質。Yang等首次利用CE-SELEX實現了對小分子物質甲基嗎啉的适配體的篩選，經過3輪篩選後獲得了8條高親和力适配體，其解離常數為到幾百nM到幾uM，其中兩條序列能夠催化中卟啉的金屬插入反應，催化強度分别為1.7倍和2倍。針對親和力較弱的适配體與靶标體系存在動态解離平衡這一問題，科研工作者發展了平衡混合物的非平衡毛細管電泳(NECEEM)、平衡混合物的平衡毛細管電泳(ECEEM)和Non-SELEX毛細管電泳技術。Ashley等應用Non-SELEX技術篩選獲得過氧化氫酶的适配體，作者應用熒光分光廣度計與毛細管親和力電泳表征了其親和力與特異性，結果顯示适配體對靶标的親和力比與其他四種蛋白的親和力高至100倍，也顯示了其高特異性。該适配體可應用于生物傳感器、免疫印迹與生物标志物鑒定。Ashley等又基于NECEEM和SELEX技術篩選獲得在自由的三維空間環境的人類瘦素蛋白的适配體，其解離常數為幾百nM。
細胞SELEX(Cell-SELEX)技術。該方法的主要靶标物質是細胞、細菌或病毒等，操作過程中采用離心、沉澱的方法分離去除未結合适配體，再通過熱解離或酶切作用獲得特異性适配體序列。Liang等針對感染狂犬病毒的活細胞，應用Cell-SELEX經過35輪重複篩選獲得了5條DNA适配體。病毒效價測定與實時定量反轉錄PCR實驗均表明篩選獲得的5條适配體能夠抑制狂犬病病毒的複制，為狂犬病感染的治療提供了一種可能性。Ninomiya等應用Cell-SELEX經過11輪重複篩選，獲得12條與人類肝癌細胞HepG2特異性結合的高親和力适配體，其解離常數範圍為19-450nM。作者分析獲得12條适配體共有的二級結構，這與HepG2識别密切相關。該方法可以在靶标性質不明确、結合位點未确定的情況下進行篩選，并且無需制備靶标的複雜過程。
适配體的優點
自20世紀90年代适配體的概念被提出以來，科研工作者不斷緻力于适配體的研究，發現适配體具有許多優點。首先，相比較傳統微生物培養，檢測周期短、檢測限低且具有高親和力與強特異性，這源于适配體具有較大表面積和大量受體結合位點且空間三維構型易形成螺旋、發卡、莖環、凸環、三葉草和假結等結構，能夠與靶标物質基于範德華力、氫鍵和疏水作用等緊密結合，并可以區分結構類似物質；其次，相比較抗體檢測，篩選獲得的适配體易于體外大量合成，重複性好、穩定性高且易于貯存；再次，相比較分子生物學，操作簡便易行，檢測成本較低；同時，适配體靶标廣泛，包括農藥、組織、細胞、病毒、蛋白質、毒素、維生素和過敏原等；适配體易于标記熒光且活性不受影響，因此易于結合應用其他檢測技術。
适配體的應用
1990年，Tuerk與Ellingtong基于SELEX技術率先分别篩選獲得了噬菌體T4DNA聚合酶與有機染料的特異性RNA适配體。自此以來，适配體已經被廣泛應用于細胞成像、新藥研發、疾病治療與微生物檢測等衆多方面。
細胞成像：熒光标記适配體或适配體複合物是适配體應用于細胞成像的基礎。流式細胞儀、熒光分光光度計常被用于測定熒光标記适配體與靶細胞結合力的大小，熒光顯微鏡能夠呈現複合物的直觀圖像。Wang等基于FISH技術和熒光标記的特異性DNA适配體構建了綠膿假單胞菌的成像檢測系統。熒光适配體探針還可以用于細胞内部的顯微成像。Valencia等基于核糖核酸結合蛋白質及其适配體間的相互作用，實現了大腸杆菌活細胞内細菌RNA的成像工作。
藥物傳送：科研工作者已經研發了多種抗癌藥物，納米材料也廣泛應用于藥物的傳送，但其具有生物相容性差、不能定向傳送且對其他細胞傷害大的缺點。适配體能夠與靶标特異性結合，納米材料-特異性适配體複合物能夠實現藥物在細胞内的定向傳遞。Chang等構建了一種五角星構型的納米材料二十面體，其與特異性适配體DNA結合後可以攜載阿黴素，定向傳送到病竈位置，特異性導緻上皮癌細胞死亡。
疾病治療：研究發現MCF7附膜抗原蛋白的特異性适配體能夠通過生物素-鍊黴親和素反應與補體組分1(C1q)結合，顯著誘導癌細胞膜的滲透壓膨脹甚至細胞死亡，對于乳癌的治療具有一定作用。适配體的動力學性質與促凋零作用表明GSH-RNA适配體是一種潛在的抗癌化學治療劑。
微生物檢測：食源性緻病菌的檢測是科學工作者研究的重要課題，目前适配體已經廣泛地應用于緻病菌的檢測。Joshi等應用SELEX技術，篩選獲得了鼠傷寒沙門氏菌的兩條适配體，其檢測下限可達10-40cfu/g，實現了環境與食品中鼠傷寒沙門氏菌的快速靈敏檢測。
