引物:現代詞語-中文百科頻道

類型

存在有自然中生物的DNA複制引物（RNA引物）和聚合酶鍊式反應(PCR)中人工合成的引物（通常為DNA引物）。一般所說引物，指DNA引物，以下簡稱引物。

設計原則

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模闆鍊互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模闆鍊互補。

在整個PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的DNA結合，PCR的靈敏性要求dna聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。

在PCR（聚合酶鍊式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，目的基因DNA受熱變性後解鍊為單鍊，引物與單鍊相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重複循環，延伸後得到的産物同樣可以和引物結合。

PCR引物設計的目的是找到一對合适的核苷酸片段，使其能有效地擴增模闆DNA序列。如前述，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則确保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。

1.引物最好在模闆cDNA的保守區内設計。

DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較确定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。

2.引物長度一般在15~30堿基之間。

引物長度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應大于38，因為過長會導緻其延伸溫度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶進行反應。

3.引物GC含量在40%~60%間，Tm值最好近72℃

GC含量（composition）過高或過低都不利于引發反應。上下遊引物的GC含量不能相差太大。另外，上下遊引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鍊溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鍊解鍊的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使複性條件最佳。

4.引物3′端要避開密碼子的第3位。

如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

引物3′端錯配時，不同堿基引發效率存在着很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鍊的合成，而當末位鍊為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。

6.堿基要随機分布。

引物序列在模闆内應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導緻錯誤引發（Falsepriming）。降低引物與模闆相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是随機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。

7.引物自身及引物之間不應存在互補序列。

引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身複性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模闆的複性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。

兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導緻産生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

8.5′端和中間△G值應相對較高3′端較低

△G值是指DNA雙鍊形成所需的自由能，它反映了雙鍊結構内部堿基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鍊越穩定。應當選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鍊結構并引發DNA聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

引物的5′端決定着PCR産物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；标記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。

引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能。

10.擴增産物的單鍊不能形成二級結構。

某些引物無效的主要原因是擴增産物單鍊二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模闆。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

11.引物應具有特異性。

引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

值得一提的是，各種模闆的引物設計難度不一。有的模闆本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導緻找不到各種指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因為産物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況隻能退而求其次，盡量去滿足條件。

做RealTime時,用于SYBRGreenI法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求：

●避免重複堿基，尤其是G.

●Tm=58-60度。

●GC=30-80%.

●3'端最後5個堿基内不能有多于2個的G或C.

●正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。

●PCR擴增産物長度：引物的産物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150bp最為合适（可以延長至300bp）。

●引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；要特别注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。

而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。　　做染料法最關鍵的就是尋找到合适的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合适的引物非常不容易。

關于BLAST的作用應該是通過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目标基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的産物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。