背景设定
该作中，库巴带领小库巴们袭击的不是蘑菇王国，而是存分散在蘑菇世界里的其他七个王国。在各国中，库巴率领自己的孩子“小库巴”们去捣乱，导致各国自古相传的魔杖被盗取，各国国王被变成了动物及植物等姿态。马里奥和路易按顺序寻访各国，帮他们取回魔杖，并恢复各个国王的姿态。但是途中，桃子公主被拐到了位于库巴总部的第8世界暗黑王国，救回桃子公主则是马里奥和路易的最终目标。
角色设定
玩家角色
与前作相同，1P玩家控制的角色是马里奥，红色的帽子和衣服是他的标志；当出现2P的时候则控制路易，绿色的帽子和衣服是他的标志。2P玩家控制路易进行游戏时，使用各种道具与马里奥具有同样的效果。
变身（能力提升）
超级马里奥（即大版马里奥）、火球马里奥基本与前作相同。小个子马里奥状态下如果直接获得【スーパーこのは】或【火焰花】的话或变为大版马里奥（在世界地图界面直接使用道具的话，不管大小马里奥，会直接完成变身），其他的变身装道具就算是小个子马里奥直接获取的话，也会直接完成变身。
使用青蛙马里奥、浣熊马里奥、锤子马里奥状态来通关世界地图时，通关时的提示信息也会有变化。
其它角色
桃子公主：蘑菇王国的公主。每当玩家通关了一个世界地图救下国王之后，她会给马里奥送来信件和道具。
蘑菇头：各国国王身边的侍从。在蘑菇之家，会给玩家提供好用的道具。
国王：统治各国的国王们。由于小库巴们的恶作剧，国王们被变成了各种姿态。
物品道具
关卡道具
道具分为，在关卡中登场的道具和在世界地图中已经获得的道具（地图道具）。关卡中登场的道具与前作一样，获得的话马上就会生效。地图道具的话，只有在地图画面上使用了才会生效，无法在关卡中调出使用。但是，能力提升系列的道具，在进入关卡前使用的话，可以对挑战关卡起到有利作用。
- 关卡中的道具
能力提升系超级蘑菇：撞击阻碍块会出现超级蘑菇，并向左或向右移动。取得的话会变身为超级马里奥，可以击碎砖块障碍。受到伤害的话会回复小个子马里奥。
火焰花：撞击阻碍块会出现在阻碍块上方，取得的话会变身为火焰马里奥，在超级马里奥的基础上，还可以发射火球。火焰花出现之后，在没取得之前受到伤害，以小个子马里奥取得的话，只会变身为超级马里奥。火焰马里奥受到伤害后会回复为小个子马里奥（重制版是恢复为超级马里奥，以下同样）。
超级叶子：撞击阻碍块会出现超级叶子并缓缓飘落。取得的话会变身为尾巴马里奥。在超级马里奥能力的基础上，还会拥有一定时间内可以飞行的能力，缓慢下落的能力，还有可以用尾巴攻击敌人的能力。浣熊马里奥、青蛙马里奥、锤子马里奥等，取得相应的道具会变身为相应的马里奥。（详细内容前面说过了）
- 其他道具
1UP蘑菇：可以增加1条命的蘑菇，撞击阻碍块会出现，并朝着左右一定方向移动。前述的巨大ハテナ阻碍块中有时也可以一下出来3个。通常是绿色，但不知是否是由于FC机能的颜色上限问题，有时会显示为白色或者紫色。
超级星星：取得可以使马里奥在一定时间内处于无敌状态，撞击阻碍块的会回出现，并跳跃式前进。无敌时间比前作要短。无敌状态的时候，小个子马里奥以外的状态跳跃的话，会翻跟头。并且，翻跟头的时候是无法进入倒立管道的。用无敌状态来撞击阻碍块有时还会出现无敌星星（非无敌状态下撞击只会出现金币），这种称作隐藏星星或者连续无敌星星，此种情况多处出现在无敌时间马上就要结束的情况下才能到达地方。也有的关卡要必须连续吃到无敌星星才能通关。
P开关（开关阻碍块）：写有P字的开关按钮。踩上去的话，在一定时间内特定的阻碍块和黑色无敌花会全部变为金币，金币会全部变为阻碍块。有时在什么都没有的情况下，踩下开关也会出现金币和隐藏的门，ベルトコンベアー也会停止。在生效时间内，ハテナブロック和弹跳阻碍块等各自的特点，以及地形的变化都会停止。
鞋子：只有在第五世界第3关中才能取得的能力提升道具（详情参考前述）。
宝箱：通常会在与锤子怪战斗胜利之后出现，也会出现在关卡中特定的位置（关卡中的宝箱基本都是隐藏道具）。这种情况下打开宝箱的话，会无条件通关。
地图道具
在蘑菇屋或者击败锤子怪时打开的宝箱中获得，或者在通关世界地图时获得，会存储在世界地图下方的道具栏中。最大可存放28个，如果继续获得的话，最新获得的道具会覆盖掉最早获得的道具。只有在世界地图页面才可以使用此种道具，无法在正在挑战的关卡中使用。在地图页面按B键可以打开道具栏，使用的话即刻生效。如果在地图画面使用了超级蘑菇或者变身装备等道具，那么再进入关卡的话，直接就以此种状态开始挑战关卡。
除了通常的道具，还存在只有在地图画面才会使用生效的特殊道具。
- 云彩：使用的话，可以在未通关某一关卡的情况下直接跳过该关卡。跳过关卡之后，如果在接下来的关卡中挑战失败，那么会回到跳过关卡之前的一个关卡，如果想再次跳过，那只能通过该关卡才可以。此外，云彩对于地图画面上的锤子怪类或者食人花类等无法直接穿过。在第二世界、第五世界中通关飞空艇关卡会无条件获得。还可以在地图画面中通过击败锤子怪可以获得。在第三世界第7关卡中，在奖励关卡的最后出现，获得的话会无条件通关。音乐盒：一定时间（回合数）内使背景音乐变化，世界地图删的锤子怪和食人花等进入睡眠状态。此时就算碰触他们也不会进入战斗状态。只是，通过按下A键还是可以直接进入战斗状态。通关第三世界的飞空艇关卡可以获得，也可以通过击倒地图上的锤子怪获得。还会出现在第5世界第1关的隐藏路线中，取得的话会无条件通关。笛子：打开存在于特定关卡中隐藏地点的宝箱会获得。使用的话会出现龙卷风，会将马里奥吹到属于瞬间移动空间的第9世界，可以根据来时的世界地图不同而直接穿越到不同的世界地图。全部共有3个，持有多个的时候在瞬间移动空间使用的话，可以穿越到更加后面的世界地图。锤子：可以击碎世界地图上的岩石，开通近道或者通往奖励关卡的道路。打败地图上的锤子怪可以获得。超级羽毛：写有P字的羽毛，使用的话表面看起来与尾巴马里奥同样，但是时刻处于能量蓄满的状态，在接下来的关卡中，除非将其通关或者接触敌人受到伤害，否则可以无需助跑时刻在天空飞行。在世界地图上，除了外形跟尾巴马里奥一样之外，胸前还多了个P字。通关一个关卡的话，会恢复成普通的尾巴马里奥。在第1、4、6世界中通关飞空艇关卡可以无条件获得，还可以在第1、3、5、7世界中，白色的隐藏蘑菇之家出现的话可以获得。此外，击败地图上锤子怪以及在第7世界的食人花关卡中可以获得。在世界地图使用超级羽毛之后，进入关卡之前再使用其他道具或者进入关卡后取得其他道具，会变身为与之相应的状态，从而解除超级羽毛的效果。但是如果事先使用超级羽毛，然后在关卡中获得浣熊马里奥变身的情况下，会在浣熊马里奥的状态下依然持续超级羽毛的效果。在第8世界的迷宫区域等飞出规定高度的话，会立即挑战失败。船锚：在小库巴的飞空艇内挑战失败的情况下，飞空艇会逃到世界地图中的其他位置。这个道具的效果就是即使挑战失败，飞空艇也不会逃窜。在第2、4、6世界中白色的隐藏蘑菇之家中可以获得。
场景地图
关卡结构
关卡的设计结构与前作同样，在8个大世界地图中，各自存在复数的关卡，到达最终的第8世界，并打败库巴的话就会迎来结局。与以往不同，各个世界中的关卡数量都是不同的，并且除了通常关卡之外还存在有特殊关卡和奖励关卡等。该作中各个世界的世界观都有很大差异，与此相对的也设计出了多彩多样的关卡布局。此外，各个世界地图也有着对应自己世界观的名字。
地图
存在8种世界地图，每张世界地图上设置了构成游戏核心的普通关卡及其他特殊关卡，还有奖励设施等，按照大富翁游戏那样的格子进行部署配置。
普通关卡（动作游戏）
普通关卡被称为“路线”，作为“动作游戏图标”被配置在世界地图上。当通关这条路线之后，图标会变为“已通关图标”，可以通过此路线。如此这般，不断将动作游戏通关，然后到达地图上的城堡，再打败小库巴，被变成动物们的各国国王就会恢复原样，以此来达成单个世界地图的通关。接下来就会进入下一个世界地图，并无法返回前一个世界地图。在第8个世界地图的最终城堡中，打败库巴之后，就会彻底通关整个游戏。关于动作游戏的关卡，基本上需要按照各个路线的编号逐个通关才能到达城堡，但是有的时候会有分歧路线，也就是不一定全部都要按照顺序来通关普通关卡有时也能到达城堡，从而通关单个世界地图。2人游戏的时候，马里奥和路易可以协力通关各个关卡。
地图上的其他设施
地图上除了上述的动作游戏图标之外，还有以下很多其他设施。
- 蘑菇屋：可以获得道具的地方。固定存在于地图之上。从3个宝箱中选择1个之后可以获得物品。外观通常为茶色（第5世界后半和第6世界为蓝色），也有红色的蘑菇屋，红色的比较容易获得稀有道具。一旦进入之后就变为“已通关图标”，无法再次进入。根据访问场所的不同一般固定为3种道具，但是具体哪个道具存在于哪个宝箱中是随机的。此外，一共存在6个无论选择哪一个宝箱都会必定获得一套变身装备的蘑菇屋。（第2世界的第3个〈=必须先有锤子道具〉，第3世界的第1个必定获得青蛙装、第4世界的第1个〈=必须先有锤子道具〉、第5世界的第1个必定获得浣熊装、第6世界的第1个合第2个必定获得锥子装）此外，满足一定条件会出现白色的蘑菇屋（重制版为蓝色），这里的宝箱会出现仅有1个的贵重道具。与通常的蘑菇屋不同，一旦碰到便自动进入，一旦进入后便会消失。单数的世界地图中可以在这里可以获得翅膀（パタパタの羽根），偶数的世界地图中在这里可以获得【船锚（イカリ）】。黑桃图标：通过连连看游戏来获得续命蘑菇的事件场所。固定存在于世界地图上。对上中下三段的牌进行连连看，如果对上的牌是蘑菇那么获得2UP，火花的话是3UP，星星的话是5UP。一旦进入就会变为“已通关图标”，无法再次进入。
N标志的黑桃图标：通过猜图游戏来获得道具、金币及续命机会的事件场所。每获得8万分时，在通关之后，出现于前一个通关过的图标上。碰到就会自动进入，18张卡片背面放置，需要猜出两两一致的图案。错误两次的话会退出游戏，等待下次机会。全部猜对的话，下次会换成新的布局。一共有8种布局。在印有N标志的黑桃牌关卡的神经衰弱游戏中，存在着背面写有N字的黑桃标志。这是真正的任天堂生产的扑克牌中黑桃A上实际印刷的标志，在此之上稍加了改动设计。
- 管道：在世界地图上去相隔较远的地方时使用。管道中为1个画面的地下世界（第5世界除外）关卡（没有敌人），进入管道之后，从另一边管道出来即可完成移动。并且，管道中也有时间限制，时间到了的话会通关失败。但是在《超级马里奥典藏版》之后的版本中取消了时间限制，只会显示为000。封闭之门：存在于世界地图上有钥匙孔的大门。打倒小城堡中的BOSS并获得魔法球之后可以解封对应的地点，可以移动到大门的另一边。GAME OVER后再接续的话，大门也不会恢复。根据世界地图的不同，大门消灭之后也可能变为一座桥。在第1世界的小城堡中，就算不拿到魔法球也可以通关小城堡，这种情况下，就算小城堡被通过关了，封闭之门也不会打开。投锤怪（回旋镖怪、火球怪、ヒマン怪）：只有1个画面的特殊动作游戏关卡。在通关某些关卡或者在某些关卡失败之后，随机出现在世界地图上。碰到话自动进入战斗画面。战斗时，通过撞击砖块会出现火球花、1UP（只有第5世界）、10金币（只有第5世界）等道具。道具的出现条件根据地图上投锤怪所处的位置不同而不同。将其击倒之后，可以获得宝箱中的道具，但是它不会变成“已通关标志”，只是单纯的消失掉。可以通过“音乐盒（オルゴール）”道具使其进入睡眠状态从而直接通过。所出现的怪物种类和数量根据各个世界地图有所不同。根据世界地图的不同，对战时的关卡背景也不同，只有第3世界时，战斗背景中有一个身位的水位，小个子马里奥的情况下，行动会受影响。宝船：在第1、3、5、6世界地图中，当所持金币数所有位数相同，且所得分数10位的数字与前面的金币数相同，在这种情况下通关关卡后，特定的怪物将变身为宝船（通关时的剩余秒数1秒=50分也会加算上去，这点要注意）。如果将这个特定怪物打败的话，就算满足条件，也不会出现宝船。宝船上为画面强制前进的动作游戏，除了最后出现的两个回旋镖怪之外不会出现敌人。船上有大量的金币和很多隐藏的1UP蘑菇，并且在打败回旋镖怪之后还能获得宝箱。在宝船上挑战失败的话，宝船会恢复成原来的怪物，宝船挑战通关的话，会消失。小城堡：存在于世界地图中重要位置的动作游戏关卡。关卡最后的BOSS是笨笨（ブンブン），将其击败并获得魔法球之后灯光会开始闪烁，计算好剩余时间奖励后小城堡会崩塌，被封锁的大门会打开或变成桥梁。根据小城堡的不同，有时会在没有获得魔法球的情况下通关小城堡，这种情况下，就算小城堡崩塌了，封闭之门也不会打开。大城堡：各个世界地图的最终目的地。里面有着被变为动物或者虫子的各国国王。首次进入的时候会直接进入飞空艇关卡。重制版中，国王被变身为其他马里奥系列的角色。飞空艇移动之后虽然可以再次与蘑菇对话，在2人游戏的情况下，通关与挑战失败时同样会进行马里奥与路易的交替。各个世界国王被变身为：第1世界：犬（重置版：ガラゲーロ）第2世界：毛虫（重置版：ターペン）第3世界：河童（重置版：ライタ）第4世界：怪獣（重置版：金刚（ドンキーコングJr.））第5世界：鸟（重置版：トンドル）第6世界：アシカ（重置版：鼹鼠（チョロプー））第7世界：火球花（ファイアパックン）（重置版：耀西）飞空艇：库巴的飞船。为画面强制滚动的动作游戏关卡。打败最深处的库巴之后会通关世界地图。首次进入大城堡的时候会马上开始该关卡，当挑战失败后，飞空艇会逃到地图上的某个位置，当碰到之后，会强制进入关卡。使用隐藏道具【船锚（イカリ）】可以防止飞空艇逃跑。沙漠：只出现于第2世界地图中的动作游戏关卡。在一定区间内会刮起龙卷风，在关卡途中，背景中的太阳也会作为敌人袭击过来。金字塔：只出现于第2世界地图中的动作游戏关卡。为地下关卡。塔：只出现于第5世界地图中的动作游戏关卡。第5世界分为地面和云上两部分，塔作为连接两部分的关卡被设置在地图上。虽然塔内部是像小城堡一样的构造，但BOSS不是笨笨，进入屋顶的管道之后会到达云上的地图。并且，从云上地图返回地面地图时只需进入云上地图中的管道即可，不用通过塔的内部。食人花（パックンフラワー）：只出现于第7世界地图中的两处特殊动作游戏关卡。关卡比较短，但会出现很多食人花和黑色无敌花（ブラックパックン），而且不会出现超级星星等道具。进入最后的房里会出现宝箱，拿到宝箱就代表通关。与投锤怪一样，碰到话就会强制进入关卡，使用道具【音乐盒（オルゴール）】的话可以使其进入睡眠状态来跳过该关卡，通关的话会消失。不会在世界地图上移动。战车、战舰、高速飞空艇：只出现于第8世界中的动作游戏关卡，碰到的话会强制进入关卡。固定显示在世界地图上，通关的话会消失。炮台（炮弹、炸弹兵）、投镖鼹鼠（プー）・喷火器（バーナー）为主要的敌人及障碍物，难度比较高。在战车1中，会有回旋镖怪、战舰、高速飞空艇，在战车2中会有笨笨在最深处等待。在战车1中打败回旋镖怪会得到装有超级星星的宝箱，并且封闭之门会消失。第8世界中通常关卡比较少，但战车，战舰类关卡比较多。迷宫：只出现于第8世界中的动作游戏关卡。也被称为“下水道”。是由5个奇怪的漩涡相连而组成，其中有3个漩涡是关卡。通过的时候根据运气不同，有可能简单的直接通过，也有可能随机被一个怪手抓入其中的某个关卡。当被抓入的时候会强制开始关卡。就算没有怪手抓住的情况下，在任意漩涡上按A键也可以直接挑战关卡。最后的房间中3个关卡共同都有放着道具【スーパーこのは】的宝箱。重制版改为就算把漩涡全部通关之后也可以再次挑战，只不过不会再出现怪手。库巴城：第8世界的最终关卡。与其他几个世界的大城堡不同，不会进入飞空艇，而是直接开始动作游戏。在最后的房间（途中有两种路线分歧）中打败库巴之后，会开启通往结局的道路。
地形
与前作同样，关卡由砖块、管道、云彩等地形构成。击碎特定的砖块会出现金币或者道具，这点也是相同。但是变化比前作更加多样化。
- 阻挡物·落脚地木块：木制的阻挡物，可以踩踏但是无法破坏。有的木制阻挡用旁边撞它的话，它会反弹，有的还在反弹的同时出现道具。砖块：跟前作同样的阻挡物，用超级马里奥以上的能力从下向上撞击的话可以将其破坏。该作中用尾巴马里奥从侧方抽打的话也可以将其破坏。有的其中藏了金币或道具。该作中新登场了一种外形跟砖块一样的敌人。第4世界中有巨型砖块，无法用尾巴击碎。白砖块：白色砖块阻挡物，跟龟壳一样可以拿起来，一直拿着过了一段时间会消失。投掷出去撞到敌人会将敌人击倒，但是撞到管道会墙壁的话不会反弹而是直接消失。也有敌人会用这个当武器。音符块：画着4分音符图案的白色阻挡物，横向触碰的话有的会反弹有的不反弹。踩到上方然后时机掌握好再按A键的话会进行大跳跃。也有的会弹出道具，从上面踩的话，道具会从下方掉出。前作中的弹簧跳台被取消了，取而代之的就是这个音符块。超级弹跳块：橘黄色的弹跳阻挡物，踩到上方然后时机掌握好的话再按A键可以进行大跳跃。飞出画面上方，进入奖励关卡。巨大ハテナ块：存在于隐藏房间里的为普通阻挡物4倍大小的ハテナ阻挡物。里面装有大量的1UP蘑菇、变身装等高级道具。同样的巨大ハテナ块中一般是同样的道具。在第4世界中会大量出现，但是这只是为了配合第4世界所有阻碍物都巨大的外观而已，并没有上述的特点。隐藏阻碍块：与马里奥第一作和第二作一样，在关卡内会有看不见的隐藏阻碍块，在隐藏阻碍块的下方，向上方穿过的话，会使其出现。有时里面会出现金币和道具。并且，隐藏阻碍块未出现的时候，是无法踩上去的。有时隐藏阻碍块隐藏的也可能是音符块或者超级跳跃块。半接触地形：长方形面板的落脚地，其四角边缘为圆形且在四角上加了钉子设计。颜色有肤色、白色、水色等各种颜色，存在于大量关卡中。从下向上跳跃的话可以穿透。在白色的落脚地上下蹲持续5秒的话可以下落到白色背景的背面，可以在一定时间内在背景后面穿行。如果行走在背景里，那么不会受到背景外面敌人的攻击。在飞空艇中是设计为コンテナ。云块：单向通行，从下向上跳跃的话可以穿过，但是无法从上向下穿过。冰块：出现于第6世界中的，脚下会打滑的阻碍块。有些冰块中冻着金币或者黑色无敌花，可以用火球将冰块融化。管道：跟前作一样是可以兼并作为移动手段的物件。里面存在食人花。水中关卡的话，会从里面喷出水流。该作中，横向的管道中也会出来食人花。此外，开口向下的管道也可以进入了。还存在途中弯曲的管道。细管道也有很多，但是无法进入，有时还会出来黑色无敌花。踏板木制踏板：普通的升降梯，悬浮在空中，有单向移动的也有来回移动的，有的踩上去才会移动，有的踩上去会掉下去。旋转踏板：由绿色的球作为轴心，并由红色的球连成一排形成的踏板。既是落脚地又是障碍物，旋转时被卷入的话会被弹飞。有的在一定时间内重复旋转或者停止动作，有的一开始不会旋转，踩上去就会旋转。有的会一直旋转。轨道踏板：在Athletics关卡中大量存在。沿着轨道移动的踏板。有的停在轨道的一端，踏上去才开始移动，有的会按照一个方向前进，在轨道尽头直接掉下。圆圈踏板：半圆形中空的踏板，踩上去后开始抖动，几秒钟之后会一下落下。在上面持续跳跃或者踩在前端，可以防止其下落。大多设置在没有落脚地的空中或熔岩上方。不可思议踏板：绘有箭头标志的踏板。马里奥踩上去之后会出现同样形状的透明踏板，并开始移动，且方向不变。一定时间后消失。超不可思议踏板：有感叹号标记，在踏板上跳跃落地后，会改变踏板的移动方向。一定时间之后会消失。云彩踏板：普通的踏板，可以从下向上穿过。但是不能从上向下穿过。
其他设置
金币或黑色无敌花有时会冻在冰块里，可以使用火球弹将其融化。陷入流沙后会被吸进去。可以通过连按跳跃键脱出。基本上被吸入到最下端就会挑战失败，但是也存在流沙下面是隐藏房间的情况。在沙漠的特定地点会产生龙卷风。被卷入的话会一定时间内无法操作，并向上向后返回路线，但是如果用助跑冲向龙卷风并跳跃的话，可以实现大跳跃。在空中战舰及战车中有时会遇到螺旋踏板，在上面跳跃的话会使其一点点旋转向前移动。但是如果不跳跃的话会马上掉下来。从下向上跳跃穿过的话会使其稍微向后移动一点。掉进熔岩中的话不管马里奥处于任何状态会立即挑战失败。碰到小城堡中设置的刺的话，会受到伤害。与熔岩不同，无敌状态就算碰到也没事，超级马里奥以上的状态碰到的话不会立即挑战失败。小城堡中，墙壁、天花板、背景等在一定周期时间中，会移动。小城堡中，搭上传送带的话会随之移动。可以通过P开关来实现一定时间的停止。进入瀑布的话会被冲向下方。
- 挑战失败的主要条件
小个子马里奥的状态下收到伤害。掉进坑穴或者熔岩。（与是否是无敌状态无关，直接挑战失败。以下几项同样）被流沙卷入画面底部。被强制滚动画面夹到画面边缘。被巨大プクプク吃掉。倒计时结束。
传送
- 与前作同样，可以通过传送来快速通关整个游戏。在该作中设置了传送专用的地图，使用隐藏道具笛子可以来到传送区域，进入相应的管道来达成传送。传送空间（表示为第9世界）使用了与同样世界地图一样的视角，且只存在传送用的管道，没有动作关卡及其他要素。传送空间分为世界地图2到4、5到7、以及8三个区域。通过1次传送无法自由地选择所有的世界地图。当马里奥处在第1世界的时候，使用笛子只可以传送到第2~4世界之间的某一个世界。马里奥处于第2~6世界的时候使用笛子可以传送到第5~7世界之间的某一个世界（也就是说在第5或者6世界时，可以逆向传送到第5世界的开头位置），当马里奥处于第7世界时，使用笛子可以传送到第8世界。在第8世界使用笛子会回到第8世界开始时的位置。此外，当处于传送空间的时候，再使用一次笛子，可以直接传送到第8世界。笛子在游戏早期阶段就可以快速得到两个，利用这个可以从游戏早期一口气传送到第8世界。在前述的传送区域中，可以实现从第6世界到第5世界的逆向传送（在GBA版中，挑战库巴之前不可以）。
游戏机制
关卡机制
基本上是与前作同样的侧面视角的跳跃动作、然后以到达右侧某个终点为目的来进行游戏。大部分的关卡都是横向从左向右进行的，但是与前作不同，基本上的路线都可以根据前进方向来朝左右两个方向自由移动。高度为画面甚至数个画面的根据前进方向而可以上下方向滚动页面的关卡也新增了新来。此外比起前作还新增了不管前进方向如何，画面都会按照一定方向强制移动的新关卡。
各个关卡的终点从旗杆改为了道具盒，触碰这个道具盒的话可以获得对应的卡片道具，然后计算剩余时间奖励便可达成通关。集够3个卡片的话可以获得1UP，当3张卡片的图案一样的时候，根据图案的不同，也可以获得2UP或更高的奖励。根据所走路线的不同，有时取代卡片道具盒，会在奖励关卡或隐藏关卡中获得宝箱，并以此通关。当获得宝箱通关时，则不计算剩余时间奖励。
能力提升的状态，也从原来的超级马里奥、火球马里奥之外，增加了尾巴马里奥、浣熊马里奥、青蛙马里奥、锤子马里奥、鞋头马里奥。有些操作只有对应的状态下才可以实现。
操作方法
玩家的操作基本与前作同样，通过十字键的左右键来移动、下键会蹲下、上键会攀登、A键跳跃、B键加速或者发射火球。再此基础上，该作还增加了如下操作：
- 一直按住B键的话可以拿起龟壳等物品。松开B键的话，会将所持物朝地面前方抛掷使其滑行移动，其撞到敌人的话，会击倒敌人。此外，拿着东西将其按在墙壁上的时候，松开B键，会直接将所持物作废掉（击倒）。在该作中新增了坡道，在坡道上按十字键的下键，马里奥可以从坡道上滑下去。下滑过程中碰到敌人，可以直接将敌人击倒（根据敌人不同，如果不能击倒的话将会受到1点伤害）。通过一直按住十字键的下键（持续下蹲），可以穿透到某些背景的后面从而到达特殊地点。通过B键加速持续一定时间后，能量槽上涨，能量槽蓄满之后可以更加高速地冲刺。在水面游泳时，按A键+十字键的上键，可以从水面跳起。在倒立管道（反向管道）的下方起跳，当马里奥（或路易）的头部碰到管道时按十字键的上键，马里奥可以进入倒立管道（前提必须是允许进入的管道才行）。当马里奥（或路易）和门重叠的时候，按十字键的上键，可以进入门中。
难易度方面不像前作《超玛2》那样的极端高难度，改为了由中盘开始到后半循序渐进的增加难度，“存在减缓难度的道具”、“可以穿越舞台世界”等，导入了很多面向不擅长动作游戏玩家的新要素。与前两作相比，舞台数量增加了几倍，但是却不存在保存功能。作为补救措施，与前两作一样，为玩家准备了跳跃舞台的方法，可以通过隐藏物品“笛子”来穿越到自己想要玩的舞台。
双人游戏
在双人游戏中，1P是马里奥，2P是路易，来交替进行游戏。只是与前前作不同的是，不只是某一方挑战失败的时候会交替，通关的时候也会进行交替。
某一方通关的关卡会在地图画面上显示为已通关关卡，另一方可以直接通过。因此，可以实现两人共同完成整个世界地图的通关。
GAME OVER时的续命操作中，可以由各玩家独立操作。续命的话，该玩家已经通关的关卡会重新恢复成挑战关卡，如果想通过，必须再次将其通关才可以。非续命，正常进行中的玩家所通关的关卡，开通的大门以及桥梁，还有地图道具等都不会有变化。蘑菇之家和黑桃卡牌关会复原，因此与旧做相比会更加容易。
存在只有双人游戏时才出现的迷你游戏。游戏内容与《马里奥兄弟》类似，与原作相比规则稍有不同，两个玩家相互竞争看谁取得更多的金币或击倒更多敌人。在世界地图上，当马里奥和路易两人的位置重叠时，任意一方按下A键的话会开始迷你游戏。当某一方倒下，或者两者相加共同击败5个敌人时，击倒敌人数量多的一方获胜，胜利的一方会获得继续进行游戏路线的权利，失败的一方会回到世界地图上按下A键那一方原本所在的位置。当某一方无法通关某个关卡，需要交换玩家帮自己通关时，利用该迷你游戏可以和平地交换游戏权，待机的一方为了独占游戏权，当对方通过自己待机所处的位置时强制按下A键可以将堆放卷入迷你游戏。此外，迷你游戏中还可以交换各自玩家在通关挑战关卡时在最后撞出的奖励卡片。当某一方玩家获得同样图案的3枚卡片时，会立即增加卡片图案对应的游戏机会数。实现方法为，迷你游戏中，踩到对方头上，被踩的一方会一瞬间僵直无法移动。除了原创的这个《马里奥兄弟》迷你游戏之外，还有其他3种原创迷你游戏，例如在关卡中看谁能提前比对手获得规定数量的金币。
BUG
- 第1世界第3关中，从超级音符阻碍块的右边冲刺踩上的话，然后直接跳到白音符阻碍块上的话，会在空中和地面来回交替往来，变得无法操作。SFC版中发生这个问题之后，倒计时还会继续。Nintendo Switch版中，会在空中死掉。在第3世界，乘船时使用笛子穿越到穿越区域的话，可以从陆地移动到海中。但是一旦入海了就无法再次回到陆地，除非还有1个笛子道具，不然无法继续进行游戏。SFC版中，乘船时无法再使用笛子。浣熊马里奥的地藏菩萨状态下，如果穿上クリボー的鞋子的话，会变为灰色的鞋子马里奥，虽然可以一直处于无敌状态移动，但是无法进入管道。想要解除这种状态的话，可以通过取得叶子变为尾巴马里奥，或者等时间结束。使用浣熊马里奥进入城堡的时候，画面切换的瞬间会变为地藏菩萨状态，有时画面会卡住。在第3-9、5-1关中，有些地方会使马里奥卡在墙里无法移动，或者上空飞行的画面变得很奇怪的地方。因此，在SFC重制版和美版中，路线做了部分更改。用无敌马里奥来打败笨笨的话，魔法球会出现在中央，并且上面的问号标志会倒过来。使用超级羽毛飞行超出画面极限的话，会直接挑战关卡失败。此时，没有马里奥从空中掉下来的动画。无法上下滑动画面，画面左右的幅度也会变窄。世界地图画面上锤子怪的移动方向和停止位置虽然已经被做好了限制，但是偶尔会发生根据周围状况的不同导致锤子怪无法无法停止移动而在两点间永远不停的往返，从而造成无法继续游戏的情况。此外，当N字黑桃牌与锤子怪重叠出现在同一个位置的时候，也会导致游戏无法继续进行。在库巴城的最终区域里，使用超级羽毛飞过墙壁去掉位于其他道路上的一层，越过那里的门之后再返回战斗的话，库巴无法吐出火球。SFC版也是同样问题。在FC版中，根据关卡的不同，有时会发生道具等色调会改变的情况，这是因为FC的机能限制造成的，在重制版中不会再发生。
此外，还存在上述之外的BUG，有些延续到了SFC版中。
游戏原声
该作中，随着容量的增加，曲目数量比前作增加了近一倍，还增加了音色的厚重感。关卡的BGM与前作一样，各个世界都是共通的，但是各个世界地图的BGM根据各个世界的世界观不同，做了相应的变化。此外，DPCM产生的打击乐器的采样声音也被应用到了需要使用打击乐器的部分，从音色和曲调两方面上，汇聚了多种风格的BGM。大部分的曲子都是新创作的，无敌状态、地下关卡、音乐盒、结尾的前奏曲、传送时的笛子音，都是从前作及《塞尔达传说》开始就计划安排的曲子。
音乐原声专辑
游戏评测
《超级马里奥兄弟3》于当年年末商战前的10月23日发售，虽然首周的销量并没有超过100万份，但这部作品充分显示了任天堂产品长卖的特征，玩家的口碑相传使得销售热潮持续不退，连续32周稳居销售榜前10位。
与前作整整隔了两年之久的该作并没有辜负玩家们的期待，宫本茂再次打造出一个绚丽的童话世界。库班又卷土重来，这次他带着自己的儿女们不但绑架了公主，还世界各国的国王都变成了动物。不用说马里奥义不容辞的又担当起了救世主。由于这次要到世界各地冒险，而且库班也配备了大炮、坦克等武器，旅途的艰辛自不用说。不过沙漠国、冰之国以及各地的风土人情也让马里奥丰富了经验，开阔了眼界，对马里奥的成长起到了不小的作用。该作出现了世界地图的模式，玩家可以在各个关卡中反复尝试，版面内容丰富多彩，人物形象变得更加卡通，马里奥第一次展示了自己的飞翔技能。值得注意的是，这是历史上卖得最好的一款不与某个游戏终端相捆绑的游戏 。（腾讯 评）
任天堂这个旷世神作系列的第三作又变成了一款错终复杂的冒险游戏。这也是任天堂最具野心的一款游戏，在这款非线性平台动作游戏中，玩家可以自主选择向哪一个世界。游戏中还充满令人耳目一新的升级道具，比如青蛙装可以让马里奥跳得更远、游得更快，浣熊装可以让马里奥发动可爱的尾巴攻击，或是进行短暂的空中飞行。没有发放各种特殊道具时，游戏则专注于自身的关卡设计，把玩家丢进上下左右滚动的关卡，再往里面塞进一些巨大的敌人，比如那只丑陋的吞食鱼。如果玩家能活下来，等待玩家的将是迄今为止所有马里奥游戏中最令人头痛的一场结局战。先干掉库巴魔王全家，然后再和Boss本人一决胜负，游戏的每个角落都隐藏着奇思妙想的点子，这就是《超级马里奥兄弟3》带给玩家的乐趣体验，也正是这款完美的8位游戏带领整个马里奥系列蹒跚地迈向了16位游戏时代。（《有生之年非玩不可的1001款游戏》 评）
