感受态

感受态

條遗传学名词
细胞能够从周围环境中摄取DNA分子,并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(competence)。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。感受态的目的是增加细胞的通透性,以便外源基因进入宿主细胞,实现转化的目的。优点是细胞膜通透性增大,方便大分子的进入。意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞,完成实验。
    中文名:感受态 外文名:competence 所属学科: 对象:受体细胞 形式:细胞膜的通透性发生变化 方式:能够吸收DNA

概述

受体细胞经过一些特殊方法(如:,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。

例如野生型大肠杆菌并不容易转化,这是由于DNA无法进入野生型大肠杆菌的细胞。经过多年的努力,科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是用化学方法处理细胞,使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞,即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术,它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的感受态有两种类型:一种是自然感受态(Natural competence),自然感受态细菌可以自由地吸收DNA,通过它来进行遗传转化;另一种是人工感受态(Artificial competence),在这种转化中,细菌发生改变使得它们能摄入外源DNA。枯草芽孢杆菌属于能够发展为自然感受态的细胞,大肠杆菌就属于需要人工处理的细胞。

感受态细胞的制备

感受态细菌细胞的转化采用氯化钙的方法。不含有质粒的大肠杆菌菌株在室温下使其解冻并加入40mLS.O.C的液体培养基。在37℃培养1h,然后将其转移到37℃摇床上以200r/min速度培养2~3h,直到达到0.2~0.4。不同细菌菌株的最适宜是不同的。在4℃下以8000r/min的速度离心1min,然后用一半体积(20mL)已灭菌的预冷的TB()溶液进行悬浮,并在冰上保存25min。如上进行另一次离心后,所得到的细胞沉淀用十分之一体积(4mL)预冷的TB()溶液进行悬浮获得感受态细胞。感受态细胞可于4℃下保存3d。

感受态细胞的保存

转移1.6mL的感受态细胞悬浮液至已消过毒的冷藏管内,并加入已灭菌的0.4mL甘油使最终浓度达到20%,混匀。甘油储液可在-4℃,-20℃和-70℃下分别储存待用。

转化效率按下公式计算:转化效率(cfu/μg)=(每皿转化子平均数×菌悬液稀释倍数)质粒微克数。实验涉及的一般转化,采用质粒。

简单高效的感受态细胞制备和质粒转化体系的建立

建立重复性好的感受态细胞的快速制备方法和质粒转化方法。采用改进的氯化钙法制备感受态细胞后,将带有目标片段的质粒转入感受态细胞,使工程菌DH5α转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,接种于添加氨苄青霉素的LB培养基上,并通过蓝白斑筛选和菌落PCR进行检测。制备的感受态细菌在不加Amp的LB平板上能较好生长,表明感受态细菌具有较强活性。感受态细菌在添加Amp的平板上不能生长,表明感受态细菌未被杂菌污染。转化后获得白色菌落1410个,转化率为1.41×105cfu/μg。菌落PCR表明获得的白色菌斑为带有目标片段的阳性菌斑。该方法十分简便,是一种适于实验室操作的高效感受态细胞的制备方法

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