分子生物学技术:研究动植物的一种技术-中文百科频道

技术分类

目前，常用的分子生物学技术有如下几种：

PCR单链构象多态性分析

PCR-单链构象多态性分析是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。PCR-SSCP技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变,通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。样品经PCR扩增后，其产物经变性后可以产生2条单链，如果存在基因突变，哪怕是一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR-SSCP分析的主要优点是简易且敏感性较高。

但是该技术不能确定突变的部位和性质。PCR-SSCP突变检测敏感性随PCR产物长度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE电泳就可能无法检出，在PCR产物或待测DNA小于200bp时，PCR-SSCP分析能够检测出70%~95%的突变。如果以毛细管电泳代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。

变性梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳利用由碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的，该手段分辨率达一个碱基。当DNA双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度（Tm)低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低，最容易解链，其次是富含AT碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。

因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。将PCR产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时，该片段低温解链部分的双链打开，部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600bp以内可以达到95%。

双链构象多态分析法

双链构象多态分析是利用荧光标记引物，通过PCR扩增出相关的研究片段作为荧光标记参照DNA分子。然后用标记参照物FLR分子与待测PCR扩增片段进行杂交。因为FLR和样本核苷酸序列相似，杂交反应液中所有DNA的正链和反义链之间将形成双链结构。只有与带荧光标记的FLR分子正链匹配的DNA双链，经过电泳后方可被DNA测序仪的激光检测系统所检测。

所以可检双链均有一样的FLR正链，杂交双链的电泳迁移率可能相同，但是由于反义单链的差异双链变性程度的差异而最终造成电泳迁移率的不同。不像SSCP技术，DSCA能够任意操纵变性双链的形成，选用不同的FLR可以达到难分样本的最佳分离效果。另外，通过调整FLR和样本待测DNA分子的比例，可专一性增强杂交异质双链信号并减弱纯合双链信号。

DSCA技术的优点还在于它依据样品经过固定检测仪的时间差，而非相同电泳时间迁移的距离差来判断突变的有无，这样就避免了诸如SSCP等技术分析中因迁移速率差异而降低的泳动速度慢的条带检测率。另一方面，DSCA的有效检测片段长度可达1kb。由于激光系统的介入，DSCA的灵敏度和上样量分别得以提高和降低，不到1秒的泳动差异也足以检测。该技术已被成功地用于囊性纤维化基因的4种突变，以及HLAÑ型基因中131种等应基因的检测。

变性-高压液相色谱分析

变性-高压液相色谱是利用DNA构型改变检测基因突变和遗传多态性的方法之一，其可以检测单核苷酸多态和可遗传的突变。实验主要过程包括PCR扩增待测和正常DNA样品，将扩增产物变性后再复性，若存在突变，在这一复性过程中可形成异源双链。在部分变性条件下，高压液相色谱分析可以有效地区分由变异碱基与正常碱基形成的异源DNA双链和正常DNA双链。

由于DHPLC的分辨率可达到1bp/kb，而且操作过程可以全部程序化、大规模化和自动化，使得实验时间大大缩短，实验准确率提高，可作为大群体任何基因突变初筛的有力手段，比SSCP有更多的优越性，具有广泛的应用前景，许多工作都已经证实了DHPLC的敏感性、有效性和准确性。

特异性等位基因扩增

等位基因特异性扩增法是基于PCR技术的一种单核苷酸突变检测法，是分析已知碱基替代或微小片段缺失和插入型突变的常规技术。在PCR的引物设计中，根据已知突变位点性质在引物3'端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补而只扩增突变型或野生型基因。