早年经历
中世纪的伊比利亚半岛上曾存在着众多伊斯兰教和天主教小国。经过几百年的兼并，到15世纪中期，主要剩下了西部的葡萄牙、中部的卡斯特和东部的阿拉贡三个王国，加上半岛最南端的穆斯林小国格拉纳达（Granada），其中最强大的是卡斯特王国。伊莎贝尔是卡斯特国王胡安二世和葡萄牙公主的女儿。1454年，胡安二世死，伊莎贝尔的异母兄恩里克四世（绰号“无能者）继位。
少女时代的伊莎贝尔很不顺利，恩里克继位后，她同母亲、弟弟阿方索搬到阿雷瓦洛一个幽闭的城堡里居住。其母（与女同名，也叫伊莎贝尔）患有精神病，时而发作。但这并不影响伊莎贝尔受到来自萨拉曼卡大学的老师们的良好教育。
1468年，对恩里克四世不满的贵族们拥立阿方索为王，一场兄弟阋墙的内战由此开始，不久阿方索突然死去，反对恩里克四世的贵族又抬出了伊莎贝尔公主来继续与之对抗。最后双方终于达成和议，停止内战，全体贵族都必须宣誓效忠恩里克四世，伊莎贝尔公主则成为王位继承人，但规定她的婚事必须得到王兄的批准。
十分有心计的伊莎贝尔公主派亲信侍从到各国去私访年轻王子。反馈回来的结论是，阿拉贡王子斐迪南品貌出众、英勇善战。伊莎贝尔便与斐迪南通信往来，最后终于私定终身。但恩里克四世却要把她嫁给葡萄牙鳏居的国王阿丰索五世，企图把伊莎贝尔抓起来。于是，1469年，伊莎贝尔迅速同斐迪南王子订婚，然后借助阿拉贡的军队武力反抗王兄的干涉。这段看来像戏剧的风流韵事，最终成全了西班牙作为一个国家的统一。
恩里克四世以伊莎贝尔不遵守协议为由，剥夺了她的继承权，改立他自己的女儿胡安娜，但由于恩里克有性无能之名，多数贵族均认为胡安娜的血统存在疑问。
1474年，恩里克死，伊莎贝尔和胡安娜均宣布自己继位，她们分别借助夫家阿拉贡和葡萄牙的力量，得到国内一部分贵族的支持。经过4年战争，葡萄牙军队被击败，伊莎贝尔终于坐稳了王位。1479年，斐迪南也继承了阿拉贡王位，两国合而为一，成为西班牙王国（但两国仍然维持各自独立的议会、法律和税制）。
宗教迫害
作为一对虔诚的天主教夫妻国王，他们对境内的异教徒，包括犹太人和穆斯林进行了迫害，并成立了宗教裁判所。就在1492年，20万拥有财富和技术的犹太人被驱逐出境，10年后摩尔人遭到了相同的命运。这也许是中世纪所有虔诚国王共有的缺憾，他们在天主教世界中得到广泛尊敬，却心安理得地对异教徒犯下了罪行。他们的宗教政策被后继者们延续下去，在卡洛斯一世和腓力二世时代达到极点。在宗教审判制度下，西班牙失去了灵气，逐渐变成一个死气沉沉的角落（而与此同时，绚烂的文艺复兴运动正在其它欧洲国家蔓延）。
评价
对于历史上每一对夫妻国王来说，很难将各自的作用严格划分开来。她与斐迪南二世是“强强组合”，不过传统上认为她的作用要更加突出。在这中间，斐迪南二世的许多努力可能也被归到了伊莎贝尔的名下。
单就赞助哥伦布远航这件事而论，她就足以排进世界最有影响的帝王的行列。目前，已有旧大陆的人在哥伦布之前到达美洲的几种假说，但无论如何，只有哥伦布的壮举才开辟了新航线，将新旧大陆连为一体。另一方面，是西班牙而不是其它国家率先占有了美洲，这使美洲大部分地区的文化打上了西班牙的烙印，一直延续到今天。
此外，伊莎贝尔给西班牙奠定了政治统一的基础，并努力在思想上一统西班牙。由于西班牙在此后100多年里建立了霸权，她留下的影响也超出了伊比利亚半岛的范围，远达拉丁美洲、尼德兰等地。
对天主教的狂热和让天主教一统天下的强烈愿望，是伊莎贝尔一世执政的主要指导思想和精神动力。这种不理智的执政思想在伊莎贝尔时代却成了统一西班牙、加强全国的凝聚力、建立海外事业的推动力量。然而，一个世纪后，这种执政思想便明显呈现了消极的一面，成为导致西班牙衰落的根源。这说明了，任何一种错误的执政思想，即使能带来一时之效，也终究不是长久之策。
